本发明属于微生物检测，具体涉及石斑鱼肠孢虫（ enterospora epinepheli）的检测引物和探针及其应用。
背景技术：
1、石斑鱼营养丰富，肉质鲜美，经济价值高，是我国南方及东南亚地区的海水重要养殖品种。2023年我国各种石斑鱼的养殖产量达到24多万吨，养殖品种有10属50多种。随着集约化规模化程度的提高，不断出现的养殖病害问题已危害了石斑鱼养殖产业的健康发展。
2、微孢子虫是近年来水产养殖中的重要寄生虫病害，目前石斑鱼中已有4种微孢子病原的报道，分别是感染清水石斑鱼（ epinephelus polyphekadion）的阿拉伯格留虫（ glugea arabica）、网纹石斑鱼（ e.chlorostigma）的匹里虫（ pleistophorasp.）、赤点石斑鱼（ e.akaara）的石斑鱼格留虫（ g.epinephelusis）和珍珠龙胆石斑鱼（ e.fuscoguttatus♀× e.lanceolatus♂）的石斑鱼肠孢虫（ enterospora epinepheli）。上述4种石斑鱼微孢子中，石斑鱼肠孢虫是新近发现并在2018年被正式命名，该病原可致感染鱼厌食、肠壁变薄、鱼体严重消瘦等症状，严重时可致感染鱼类的大量死亡。病原的灵敏及特异检测是病原防控的基础，目前该病原的分子检测有常规pcr和基于taqman探针的荧光定量pcr方法。
3、taqman-mgb探针是荧光定量pcr检测方法中的一种新型探针，其3’端加入一个可插入dna小沟的小沟结合物（minor groove binder，mgb）后，有效提升探针的tm值，提高对样品检测的特异性。mgb探针5'端标记荧光基团，3'端标记非荧光淬灭基团（nonfluorescent quencher，nfq），通过nfq基团淬灭5'端荧光报告基团产生的信号，可以有效降低荧光背景信号，进一步提高检测中的灵敏度。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，lamp）是一种基因等温扩增技术，该方法中基本引物包括有4条，即f3、b3、fip（引物f1c和f2组成）和bip（引物b1c和b2组成）。lamp检测引物中还可添加也可启动链置换dna合成的1对loop环引物，即lf（引物f1c和f2之间）和lb（引物b1c和b2之间），可进一步提高反应速度，但loop环引物受限引物设计的要求和有限的序列区间不易设计得到，有时仅能设计出环引物中的一条或不能设计。lamp检测可在一个简易的恒温装置（如水浴锅或金属浴等）条件下即可完成基因的等温快速扩增，检测结果判断中，通过扩增产物中焦磷酸镁白色沉淀的有无或添加核酸染料后的颜色变化，即可实现肉眼对检测结果的判断。较常规pcr方法，lamp检测无需专用设备、模板变性、温度循环和电泳分析等步骤，且具有检测快速、特异性强和灵敏度高的优点，适合用于病原现场诊断检测试剂盒产品的开发。在lamp反应体系中，加入如evagreen®核酸染料，置于定量pcr仪中，还可通过对产物与荧光染料结合后荧光信号的强度分析，实现无需标记探针下的对靶基因的实时定量检测。目前对石斑鱼肠孢虫尚没有上述的基于taqman-mgb探针的定量检测和lamp检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针及其应用。本发明从采集的感染石斑鱼肠孢虫的珍珠龙胆石斑鱼的样品中提取dna，针对石斑鱼肠孢虫small subunitribosomal rna（ssurrna）基因设计检测引物和探针。
2、本发明通过以下技术方案实现：
3、本发明所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物及探针，包括3套等温扩增的引物和1套荧光定量pcr检测引物和探针，其核苷酸序列如下：
4、（1）3套等温扩增引物的核苷酸序列如下：
5、1）第一套引物组成及核苷酸序列：
6、引物1：e.ep_f3_1：5’-aacacgatgataaaaatcgtaga-3’，如seq id no：1所示；
7、引物2：e.ep_b3_1：5’-tgctagaattacagcggtat-3’，如seq id no：2所示；
8、引物3：e.ep_fip_1：
9、5’-tccaggtagagtctagagatttcattttttttgctaaatattgctagcgg-3’，如seq id no：3所示；
10、引物4：e.ep_bip_1：
11、5’-gaggcgaaagcgacgttcttttttctaatcactttcaatactccagc-3’，如seq id no：4所示；
12、引物5：e.ep_lf_1：5’-cctataccacgttccctatccatt-3’，如seq id no：5所示；
13、引物6：e.ep_lb_1：5’-agacgtatccgagggtcaag-3’，如seq id no：6所示。
14、2）第二套引物组成及核苷酸序列：
15、引物1：e.ep_f3_2：5’-ggatagtacagccgcaag-3’，如seq id no：7所示；
16、引物2：e.ep_b3_2：5’-tccaacacttaagttaaagatca-3’，如seq id no：8所示；
17、引物3：e.ep_fip_2：
18、5’-cgttgagttaaattaagcggcataattttactgaaacttaaacgatattggc-3’，如seq idno：9所示；
19、引物4：e.ep_bip_2：
20、5’-ggaaaacttaccagggtcaagttttttcatcaatttacaacggccat-3’，如seq id no：10所示；
21、引物5：e.ep_lf_2：5’-tccactactggtggtaaacttcc-3’，如seq id no：11所示；
22、引物6：e.ep_lb_2：5’-catgagataaacgagagtggtgc-3’，如seq id no：12所示。
23、3）第三套引物组成及核苷酸序列：
24、引物1：e.ep_f3_3：5’-acggtaacctgtggctaa-3’，如seq id no：13所示；
25、引物2：e.ep_b3_3：5’-cgtctaataaatgtctcttctcaa-3’，如seq id no：14所示；
26、引物3：e.ep_fip_3：
27、5’-cgtcacccattgttgccttgttttgcgcagtcctattatgtttg-3’，如seq id no：15所示；
28、引物4：e.ep_bip_3：
29、5’-aatcagggtttgattccggagagttttaagtggacaattttcgcg-3’，如seq id no：16所示；
30、引物5：e.ep_lf_3：5’-ggagtccattacactaccaa-3’，如seq id no：17所示；
31、引物6：e.ep_lb_3：5’-ggagcctgagagatggc-3’，如seq id no：18所示。
32、（2）荧光定量pcr检测引物和探针的核苷酸序列：
33、引物1：e.ep_f：5’-acgtccgtagctgtagatgcaa-3’，如seq id no：19所示；
34、引物2：e.ep_r：5’-cctctgttggtccaggtagagtc-3’，如seq id no：20所示；
35、探针：e.ep_p：5’-cgtggtataggtagacaaag-3’，如seq id no：21所示。
36、石斑鱼肠孢虫的等温扩增技术的检测中，可使用第一、二和三套引物中的引物1-4，还可以为引物1-6。
37、基于lamp的等温扩增的反应程序为：60.0℃-68.4℃恒温1min，20-60个循环，优选64.0℃-66.4℃，更优选65.7℃。等温扩增的反应体系中各组分用量包括：mgso4的终浓度（包括1×isothermal amplification buffer中2.0mm mg2+）为4.0-12.0mm，dntps的浓度为0.8-1.8mm， bst2.0 warmstart®dna聚合酶的浓度为0.128-0.576u/μl，甜菜碱（betaine）的浓度为0-1.4mm，优选，mgso4的终浓度为6.0mm，dntps的浓度为1.2mm， bst2.0 warmstart®dna聚合酶的浓度为0.512u/μl，甜菜碱的浓度为0.2mm。上述反应体系中，也可以添加浓度为0.5-2.5μm的evagreen®dye，优选0.75μm。反应结束后体系置于80℃，5min终止反应。扩增反应中，经95℃变性后的待检样品dna模板加入反应体系中。
38、所述等温扩增引物（包括第一、二和三套）在应用中，可进行病原的定性检测和定量检测，其检测结果的判断包括如下方法：
39、（1）定性检测：
40、（a）电泳：反应体系中不添加evagreen®dye，检测可以置于pcr仪、水浴锅或金属浴等仪器中。在阴性对照检测无污染的情况下，阳性样品和检测样品的电泳产物为阶梯状的条带视为病原检测阳性，反之视为病原的样品检测为阴性；
41、（b）肉眼观察：反应体系中不添加evagreen®dye，检测可以置于pcr仪、水浴锅或金属浴等仪器中。在扩增反应的产物中按2%体积比添加如genefindertm的核酸染料，阳性样品和检测样品的扩增产物由橙黄色变为荧光绿色视为病原检测阳性，而阴性对照和阴性样品为橙黄色；扩增产物中有明显的白色沉淀（焦磷酸镁）产生，视为病原检测阳性；
42、（c）扩增曲线分析：反应体系中添加evagreen®dye，置于定量pcr仪器中。检测结果通过扩增曲线进行分析，在阴性对照无污染的情况下，阳性样品和检测样品有扩增曲线视为病原检测阳性。
43、（2）定量检测：在上述的定性检测中的扩增曲线分析中，可根据模板量与ct值间的线性关系和检测样品的ct值进行样品中病原载量的计算。使用所述等温扩增第一套引物进行检测时，质粒标准品核酸拷贝数的对数值x与ct值y的线性表达式为y=-1.7195x+23.971。
44、所述荧光定量pcr检测引物和探针的应用方式：使用探针时，探针5’端和3’端分别修饰荧光报告基团和荧光淬灭基团，优选，探针为taqman-mgb探针，5’端修饰荧光报告基团6-carboxyfluorescein（6-fam），3’端修饰mgb-nfq。检测中，反应温度为55-62℃，优选58℃；引物和探针终浓度均为0.1-0.5μm，优选0.3μm。在定性检测的检测结果判断中，在阴性对照检测无污染的情况下，阳性样品和检测样品有扩增曲线时，视为病原检测阳性。不使用探针时，可在反应体系中添加核酸荧光染料，如sybrgreen ⅰ等，若阳性样品和检测的扩增产物的溶解曲线为单峰图，视为样品病原检测阳性。使用所述荧光定量pcr检测引物及taqman-mgb探针进行石斑鱼肠孢虫的检测时，质粒标准品核酸拷贝数的对数值x与ct值y的线性表达式为y=-3.195x+42.413。定量分析中，可根据模板量与ct值间的线性关系和检测样品的ct值进行样品中病原载量的计算。
45、本发明所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针用于石斑鱼肠孢虫的检测及定量分析，也包括用于该病原的检测试剂或试剂盒产品的开发应用。
46、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
47、1、特异性强
48、本发明基于流行病学调查所获的和对已公开的石斑鱼肠孢虫ssu rrna基因的分析结果，确定其基因的保守区域，所设计的引物及探针可适合于不同株的石斑鱼肠孢虫的特异检测。
49、2、检测灵敏快速并可提供定量分析的结果
50、本发明等温扩增可在20min内，完成对2.68×102-2.68×109拷贝范围的目的基因的检测，还可在不用标记的探针条件下实现对病原的荧光定量pcr检测；荧光定量pcr检测在60分钟内可完成，其对目的基因的6.1拷贝/反应的检测灵敏度优于已报道的该病原其他检测方法，适合用于病原的早期诊断和预警。
51、3、检测操作简单可用于现场诊断
52、本发明等温扩增的引物可在简易恒温条件（如水浴锅或金属浴中）下完成检测反应，通过反应产物中加入核酸荧光染料sybr green或genefindertm或金属离子指示染料钙黄绿素等后，肉眼即可进行检测结果的现场判断，适合于现场诊断试剂盒产品的开发。
1.一种石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针，其特征在于：所述的引物和探针的核苷酸序列如下：
2.一种权利要求1所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：用于非疾病的诊断和治疗目的石斑鱼肠孢虫的检测。
3.如权利要求2所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用所述的等温扩增引物进行石斑鱼肠孢虫的检测时，使用引物为各套引物中的引物1-4或引物1-6。
4.如权利要求3所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：反应温度为60.0℃-68.0℃，反应体系中mgso4的浓度为4.0-12.0mm，dntps的浓度为0.8-1.8mm，dna聚合酶的浓度为0.128-0.576u/μl，甜菜碱的浓度为0.0-1.4mm。
5.如权利要求4所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：反应体系还包括终浓度为0.5-2.5μm的evagreen® dye。
6.如权利要求3所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用所述等温扩增第一套引物进行检测时，质粒标准品核酸拷贝数的对数值x与ct值y的线性表达式为y=-1.7195x+23.971。
7.如权利要求2所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用荧光定量pcr检测引物及探针进行石斑鱼肠孢虫的检测时，所述探针的5’端和3’端分别修饰荧光报告基团和荧光淬灭基团。
8.如权利要求7所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：引物和探针终浓度均为0.1-0.5μm。
9.如权利要求7所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用所述荧光定量pcr检测引物及探针进行石斑鱼肠孢虫的检测时，质粒标准品核酸拷贝数的对数值x与ct值y的线性表达式为y=-3.195x+42.413。
10.如权利要求2所述的石斑鱼肠孢虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：用于制备石斑鱼肠孢虫的检测试剂或试剂盒产品。
