本发明属于生物，具体涉及一种去除滋养层细胞法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物的培养体系及其方法和应用。
背景技术：
1、近年来，细胞治疗技术发展迅速，尤其是nk细胞免疫疗法已被广泛应用于临床。nk细胞是人体天然免疫系统效应细胞，是体内监视恶性病变细胞主要功能细胞，其无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞，故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞内细菌感染的免疫应答中有重要作用。nk细胞在外周血单个核细胞中的比例仅占10-20%，当疾病发生时，受困于患者自身情况的影响，一些患者不适宜抽取自身外周血进行nk细胞体外扩增。这时就需要选择新的nk细胞来源，相较于成人外周血nk细胞，脐带血来源的nk细胞免疫原性更低，同时纯净度更高、干扰素表达能力更强，拥有更强的骨髓归巢功能。
2、nk细胞体外制备有几大要求，细胞扩增数量、nk细胞纯度以及nk细胞的杀伤性。如何得到足够的优质效应nk细胞是最核心的难点之一。原代nk细胞的体外培养大体分为细胞因子法和滋养细胞法。滋养细胞法能实现nk细胞的快速扩增，得到高纯度高质量的nk细胞，且具有良好的稳定性，但利用该方法制备脐血nk细胞制剂后，细胞制剂袋在短时间内容易出现了肉眼可见的絮状物，影响临床使用。
3、nk细胞制剂袋在短时间内出现絮状物的原因并不明确，因为这一现象可能涉及多种复杂的因素。如（1）细胞形态与行为：在某些情况下，nk细胞可能在培养过程中迅速增殖并聚集在一起，形成团块。这些团块在视觉上可能呈现为絮状物，尤其是在细胞密度较高或培养条件变化时。另外，如果nk细胞在制备或储存过程中受到不利因素的影响（如温度波动、营养不足、污染物等），它们可能会发生凋亡或死亡。死亡的细胞及其碎片可能形成絮状物，从而影响制剂的纯净度和质量。（2）培养体系因素：培养体系中的某些成分（如自体灭火血浆中的纤维蛋白原以及其他蛋白质、多糖等）可能在特定条件下（如温度、ph值、离子强度等）与细胞或细胞碎片结合形成非常坚固的交联絮状物。（3）溶液因素：nk细胞制剂在储存或运输过程中，如果溶液的稳定性受到破坏（如温度波动、光照、振动等），也可能导致絮状物的产生。
4、絮状物的出现与制剂的质量问题相关，可能由细胞凋亡、培养体系成分、运输条件等多种因素引起。解决这一问题能够显著提高nk细胞制剂的纯度、稳定性和安全性，确保其在临床应用中的有效性和可靠性。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种去除滋养层细胞法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物的方法，从而解决细胞制剂出现絮状物影响临床使用的问题。
2、一方面，本发明提供了一种nk细胞的培养体系，所述的培养体系包括血清替代物。
3、具体地，所述的血清替代物不含有纤维蛋白原。
4、优选地，所述的血清替代物添加量为补液体积的1%-5%，如1%、2%、4%、4%、5%，以及其范围内的任一点值。
5、具体地，所述的培养体系还包括无血清培养基、细胞扩增试剂和细胞因子中的一种或多种。
6、进一步具体地，所述的无血清培养基可以是kbm581、aim-v，gt-t551 h3或scgm。
7、进一步具体地，所述的细胞因子包括但不限于：il-2、il-7、il-12或il-15中的一种或多种。
8、优选地，所述的细胞因子可以是il-2。
9、进一步优选地，所述的il-2添加量可以是100-300iu/ml，如100iu/ml、200iu/ml、300iu/ml，以及其范围内的任一点值。
10、又一方面，本发明提供了一种nk细胞培养的方法，所述的方法包括以下步骤：
11、（1）细胞接种：将单个核细胞加入培养体系a，进行培养；
12、（2）换液：将步骤（1）的培养体系a替换为培养体系b，继续培养；
13、（3）第一次补液：向步骤（2）添加培养体系b，继续培养；
14、（4）第二次补液：向步骤（3）添加培养体系a，继续培养；
15、（5）第三次补液：向步骤（4）添加培养体系c，继续培养；
16、（6）收获细胞；
17、所述的培养体系a包括无血清培养基、细胞扩增试剂、il-2和血清替代物；
18、所述的培养体系b包括无血清培养基、il-2和血清替代物；
19、所述的培养体系c包括无血清培养基、il-2；
20、所述的血清替代物不含有纤维蛋白原。
21、具体地，步骤（1）-（5）所述培养的条件可以是：2％-5％co2，35-37℃。
22、优选地，步骤（1）-（5）所述培养的条件可以是：4％-5％co2，36-37℃。
23、进一步优选地，步骤（1）-（5）所述培养的条件可以是：5％co2，37℃。
24、具体地，所述的培养体系a中的血清替代物添加量可以是1%-5%v/v，il-2添加量为100-300iu/ml。
25、进一步具体地，一些实施例，所述的培养体系a中的血清替代物添加量可以是5%v/v，il-2添加量为200iu/ml；
26、另一些实施例，所述的培养体系a中的血清替代物添加量可以是1%v/v，il-2添加量为200iu/ml；
27、或者，又一些实施例中为上述两种添加方式先后添加。
28、或者，又一些实施例中可以是先添加血浆，然后添加上述两种方式种的任一种。
29、具体地，所述的培养体系b中血清替代物添加量为3%-5%v/v，il-2添加量为100-300iu/ml。
30、进一步具体地，一些实施例，所述的培养体系a中的血清替代物添加量可以是3%v/v，il-2添加量为200iu/ml；
31、另一些实施例，一些实施例，所述的培养体系a中的血清替代物添加量可以是5%v/v，il-2添加量为200iu/ml；
32、或者，又一些实施例中可以是上述两种添加方式先后添加。
33、或者，又一些实施例中可以是先添加血浆，然后添加上述两种方式种的任一种。
34、具体地，所述的培养体系c中的il-2添加量为100-300iu/ml。
35、优选地，所述的培养体系c中的il-2添加量为200iu/ml。
36、进一步具体地，所述的血清替代物为helios uitragrotm-advanced 血清替代物，购于helios bioscience公司，货号hpcfdcgl05。
37、又一方面，本发明提供了前述的培养体系或方法在去除滋养层细胞法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物中的应用。
38、本发明所取得的技术效果：
39、本发明提供了一种去除滋养层细胞k562法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物的方法，从而解决最终细胞制剂出现絮状物影响临床使用；本发明提供了血清替代物的一种新型用法，即用于滋养层细胞k562法制备脐血nk细胞制剂；所述血清替代物不含有纤维蛋白原，从根本上解决了滋养层细胞k562法培养脐血nk细胞制剂出现肉眼可见絮状物影响临床使用的问题；所述滋养层细胞k562法使用血清替代物替代脐血自体血浆用于nk细胞的培养，nk细胞生长快速且稳定，纯度以及生物学活性较高；所述血清替代物为临床级别，可用于临床研究。
1.一种nk细胞的培养体系在去除滋养层细胞法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物中的应用，其特征在于，所述的培养体系包括血清替代物；所述的血清替代物不含有纤维蛋白原。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的培养体系还包括无血清培养基、细胞扩增试剂和细胞因子中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的无血清培养基为kbm581、aim-v，gt-t551 h3或scgm。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的细胞因子包括il-2、il-7、il-12或il-15中的一种或多种。
5.一种nk细胞培养的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）-（5）所述培养的条件为：2％-5％co2，35-37℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养体系a中的血清替代物添加量为1%-5%v/v，il-2添加量为100-300iu/ml。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养体系b中血清替代物添加量为3%-5%v/v，il-2添加量为100-300iu/ml。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养体系c中的il-2添加量为100-300iu/ml。
10.权利要求5-9任一项所述的方法在去除滋养层细胞法制备脐血nk细胞制剂出现絮状物中的应用。
