背景技术：
1、大型多样化dna货物的独立于dna修复的可编程、高效、多路复用的基因组整合仍然是基因组编辑中尚未解决的挑战。当前的基因整合方法需要双链断裂，引发dna损伤反应，并且依赖于在终末分化细胞中不活跃的修复途径。此外，绕过双链断裂的基于crispr的方法(诸如先导编辑)仅限于短序列的修饰或插入。
2、本领域需要以下技术，其解决并克服这些缺点，并且能够将大序列插入到细胞中和/或将其从细胞中删除，以在原核系统以及真核系统中用于为了广泛目的的治疗和基于回路的用途的。
技术实现思路
1、本文描述了一种单一核酸构建体，其允许使用单一组分dna的dna递送将任何模板掺入到任何dna基因座中。此外，核酸构建体的物理部分能够自身环化，从而形成含有dna模板的环状构建体。此外，核酸构建体可以在任何病毒或非病毒递送载体中包装和递送，所述载体包括重组腺病毒、辅助依赖性腺病毒、aav、hsv、指环病毒(annelovirus)、逆转录病毒、慢病毒、doggybonetmdna(dbdnatm)、微环、质粒、微型dna、lnp或纳米质粒。核酸构建体的递送也可以通过融合体或外泌体进行(参见，例如，wo2019222403，其通过引用并入本文)。核酸构建体的递送也可以通过vesicas进行(参见，例如，us20210261957a1，其通过引用并入本文)。
2、本公开提供了核酸组合物、方法以及用于位点特异性遗传工程的总体平台，其使用经由位点特异性靶向元件的可编程添加(paste)(参见，ionnidi等人；doi：10.1101/2021.11.01.466786；其全部内容通过引用并入本文)、转座子介导的基因编辑、或包装到单一核酸构建体(在一些情况下描述为“安装者”)中的其他合适的基因编辑或基因掺入技术。paste的非限制性实例包括如美国专利公开号2022/0154224中所述的那些实例，所述专利通过引用整体并入本文。本文描述了“安装者”核酸构建体，其编码先导编辑器系统或基因编写蛋白、一种或多种含有附接位点的指导rna(atgrna)、任选地，切口酶指导rna(ngrna)、整合酶、核酸货物以及任选地，重组酶。整合酶可以例如通过肽接头直接连接至先导编辑器融合或基因编写蛋白。本文所述的核酸构建体可用于将大片段dna(以及小片段dna)引入任何生物体的任何基因组位点、自任何生物体的任何基因组位点删除、或者删除并引入。本文所述的技术可广泛用于治疗、诊断、农业、研究并且用于基于遗传和蛋白质的回路的一般包含。
3、在一个方面，本公开的特征在于一种核酸构建体，其包含：编码先导编辑器系统的核苷酸序列；编码至少第一含有附接位点的指导rna(atgrna)的核苷酸序列；编码至少第一整合酶的核苷酸序列；核酸货物；任选地，编码切口酶指导rna(ngrna)的核苷酸序列；以及任选地，编码重组酶的核苷酸序列。
4、在一些实施方案中，先导编辑器系统包含编码切口酶的核苷酸序列和编码逆转录酶的核苷酸序列。
5、在一些实施方案中，编码切口酶的核苷酸序列和编码逆转录酶的核苷酸序列位于构建体中，使得当表达时，基因编辑器系统包含有包含切口酶和逆转录酶的融合蛋白。
6、在一些实施方案中，由核酸构建体中的核苷酸序列编码的第一整合酶通过接头融合至先导编辑器系统、切口酶或逆转录酶。
7、在一些实施方案中，第一atgrna包含能够将先导编辑器系统指导至靶序列的结构域；以及包含至少第一整合识别位点的一部分的逆转录酶(rt)模板。
8、在一些实施方案中，rt模板包含第一整合识别位点的全部。
9、在一些实施方案中，将核酸构建体引入细胞中后，第一atgrna将第一整合酶识别位点掺入到细胞的基因组中的靶序列处。
10、在一些实施方案中，核酸构建体还包含第二atgrna。
11、在一些实施方案中，第一atgrna和第二atgrna是至少第一对atgrna，其中至少第一对atgrna具有能够将先导编辑器系统指导至靶序列的结构域，第一atgrna还包括第一rt模板，所述第一rt模板包含至少第一整合识别位点的一部分；并且第二atgrna还包括第二rt模板，所述第二rt模板包含至少第一整合识别位点的一部分，并且第一atgrna和第二atgrna共同编码第一整合识别位点的全部。
12、在一些实施方案中，将核酸构建体引入细胞中后，第一对atgrna将第一整合酶识别位点掺入到细胞的基因组中的靶序列处。
13、在一些实施方案中，核酸构建体还包含第二整合酶识别位点。
14、在一些实施方案中，第二整合酶识别位点和第一整合酶识别位点是第一同源对。
15、在一些实施方案中，核酸构建体还包含第三整合酶识别位点。
16、在一些实施方案中，核酸构建体还包含第四整合酶识别位点。
17、在一些实施方案中，第三整合酶识别位点和第四整合酶识别位点是第二同源对。
18、在一些实施方案中，第二同源对具有比第一同源对更快的整合速率，由此在第一整合酶的存在下，第二同源对在第一同源对重组之前重组。
19、在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码第二整合酶的核苷酸序列。
20、在一些实施方案中，第一整合酶、第二整合酶或两者选自bxbl、bcec、sscd、sacd、int10或pa01。
21、在一些实施方案中，第一整合酶和第二整合酶识别不同的整合识别位点。
22、在一些实施方案中，核酸构建体还包含至少第一重组酶识别位点。
23、在一些实施方案中，核酸构建体还包含第二重组酶识别位点。
24、在一些实施方案中，重组酶是flp或cre。
25、在一些实施方案中，核酸货物包含以下项中的至少一种：基因、表达盒、逻辑门系统(logic gate system)或其任何组合。
26、在一些实施方案中，核酸构建体还包含核酸构建体的子序列，其能够自身环化以形成自身环状核酸。
27、在一些实施方案中，核酸构建体的能够自身环化的子序列包含核酸货物，由此在自身环化后，自身环状核酸包含核酸货物。
28、在一些实施方案中，子序列侧接有第三整合酶识别位点和第四整合酶识别位点。
29、在一些实施方案中，子序列包含第二整合酶识别位点。
30、在一些实施方案中，自身环化由第一整合酶对第三整合酶识别位点和第四整合识别位点的重组介导。
31、在一些实施方案中，子序列侧接有第一重组酶识别位点和第二重组酶识别位点。
32、在一些实施方案中，自身环化由重组酶对第一重组酶识别位点和第二重组识别位点的重组介导。
33、在一些实施方案中，自身环状核酸包含一个或多个额外的整合识别位点，其能够整合额外的核酸货物。
34、在一些实施方案中，在将核酸构建体引入细胞中后并且在自身环化以形成自身环状核酸后，包含第二整合酶识别位点的自身环状核酸能够整合到细胞的基因组中的含有第一整合酶识别位点的靶序列处。
35、在一些实施方案中，形成自身环状核酸的自身环化由第一整合酶实现，并且自身环状核酸的整合由第二整合酶实现。
36、在一些实施方案中，核酸构建体还包含5′反向末端重复序列(itr)。
37、在一些实施方案中，核酸构建体还包含3′反向末端重复序列(itr)。
38、在另一个方面，本公开的特征在于一种包含本文所述的任何核酸构建体的载体。
39、在一些实施方案中，载体是重组腺病毒、辅助依赖性腺病毒、aav、慢病毒、hsv、指环病毒、逆转录病毒、doggybonetmdna(dbdnatm)、微环、质粒、微型dna或纳米质粒。
40、在另一个方面，本公开的特征在于一种包含本文所述的任何核酸构建体或本文所述的任何载体的药物组合物。
41、在另一个方面，本公开的特征在于一种包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的任何药物组合物的方法。
1.一种核酸构建体，其包含：
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述先导编辑器系统包含编码切口酶的核苷酸序列和编码逆转录酶的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其中编码所述切口酶的所述核苷酸序列和编码所述逆转录酶的所述核苷酸序列位于所述构建体中，使得当表达时，所述基因编辑器系统包含有包含所述切口酶和所述逆转录酶的融合蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸构建体，其中由所述核酸构建体中的核苷酸序列编码的所述第一整合酶通过接头与所述先导编辑器系统、所述切口酶或所述逆转录酶融合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一atgrna包含
6.如权利要求5所述的核酸构建体，其中所述rt模板包含所述第一整合识别位点的全部。
7.如权利要求1-6中任一项所述的核酸构建体，其中在将所述核酸构建体引入细胞中后，所述第一atgrna将所述第一整合酶识别位点掺入到所述细胞的基因组中的所述靶序列处。
8.如权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，其还包含第二atgrna。
9.如权利要求8所述的核酸构建体，其中所述第一atgrna和所述第二atgrna是至少第一对atgrna，其中
10.如权利要求9所述的核酸构建体，其中在将所述核酸构建体引入细胞中后，所述第一对atgrna将所述第一整合酶识别位点掺入到所述细胞的基因组中的所述靶序列处。
11.如权利要求1-10中任一项所述的核酸构建体，其还包含第二整合酶识别位点。
12.如权利要求11所述的核酸构建体，其中所述第二整合酶识别位点和所述第一整合酶识别位点是第一同源对。
13.如权利要求11或12所述的核酸构建体，其还包含第三整合酶识别位点。
14.如权利要求11-13中任一项所述的核酸构建体，其还包含第四整合酶识别位点。
15.如权利要求14所述的核酸构建体，其中所述第三整合酶识别位点和所述第四整合酶识别位点是第二同源对。
16.如权利要求10-15中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二同源对具有比所述第一同源对更快的整合速率，由此在所述第一整合酶的存在下，所述第二同源对在所述第一同源对重组之前重组。
17.如权利要求1-16中任一项所述的核酸构建体，其还包含编码第二整合酶的核苷酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一整合酶、所述第二整合酶或两者选自bxb1、bcec、sscd、sacd、int10或pa01。
19.如权利要求17或18所述的核酸构建体，其中所述第一整合酶和所述第二整合酶识别不同的整合识别位点。
20.如权利要求1-19中任一项所述的核酸构建体，其还包含至少第一重组酶识别位点。
21.如权利要求20所述的核酸构建体，其还包含第二重组酶识别位点。
22.如权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体，其中所述重组酶是flp或cre。
23.如权利要求1-22中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸货物包含以下项中的至少一种：基因、表达盒、逻辑门系统或其任何组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的核酸构建体，其还包含所述核酸构建体的能够自身环化以形成自身环状核酸的子序列。
25.如权利要求24所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体的能够自身环化的所述子序列包含所述核酸货物，由此在自身环化后，所述自身环状核酸包含所述核酸货物。
26.如权利要求24或25所述的核酸构建体，其中所述子序列侧接有所述第三整合酶识别位点和所述第四整合酶识别位点。
27.如权利要求26所述的核酸构建体，其中所述子序列包含所述第二整合酶识别位点。
28.如权利要求25-27中任一项所述的核酸构建体，其中自身环化由所述第一整合酶对所述第三整合酶识别位点和所述第四整合酶识别位点的重组介导。
29.如权利要求28所述的核酸构建体，其中所述子序列侧接有所述第一重组酶识别位点和所述第二重组酶识别位点。
30.如权利要求29所述的核酸构建体，其中自身环化由所述重组酶对所述第一重组酶识别位点和第二重组酶识别位点的重组介导。
31.如权利要求24-30中任一项所述的核酸构建体，其中所述自身环状核酸包含能够整合额外的核酸货物的一个或多个额外的整合识别位点。
32.如权利要求24-31中任一项所述的核酸构建体，其中在将所述核酸构建体引入细胞中后并且在自身环化以形成所述自身环状核酸后，包含所述第二整合酶识别位点的所述自身环状核酸能够整合到所述细胞的基因组中的含有所述第一整合酶识别位点的所述靶序列处。
33.如权利要求32所述的核酸构建体，其中形成所述自身环状核酸的自身环化由所述第一整合酶实现，并且所述自身环状核酸的整合由所述第二整合酶实现。
34.如权利要求1-33中任一项所述的核酸构建体，其还包含5′反向末端重复序列(itr)。
35.如权利要求1-34中任一项所述的核酸构建体，其还包含3′反向末端重复序列(itr)。
36.一种载体，其包含如权利要求1-35所述的核酸构建体中的任一种。
37.如权利要求36所述的载体，其中所述载体是重组腺病毒、辅助依赖性腺病毒、aav、慢病毒、hsv、指环病毒、逆转录病毒、doggybone dna(dbdna)、微环、质粒、微型dna或纳米质粒。
38.一种药物组合物，其包含如权利要求1-37所述的核酸构建体或载体中的任一种。
39.一种方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求38所述的药物组合物。
