背景技术：
1、多聚谷氨酰胺(polyq)疾病是一组由在相应蛋白质中扩增的编码长polyq束的胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(cag)重复序列引起的神经退行性紊乱。迄今为止，已经描述了至少九种polyq紊乱：六种脊髓小脑共济失调(sca)1型、2型、6型、7型、17型；马查多-约瑟夫病(mjd/sca3)；亨廷顿病(hd)；齿状核红核苍白球路易体萎缩(drpla)；和脊髓延髓性肌萎缩，x连锁1(smax1/sbma)。
2、目前，对这些疾病既无法治愈也无法预防，并且仅存在对polyq疾病的对症治疗。到目前为止，长期药物治疗令人失望，可能是由于不希望的并发症和药物疗效下降。
3、在polyq疾病中，亨廷顿病(hd)是高加索裔(caucasian)群体中最普遍的单基因神经退行性紊乱(每100,000人中～7-11人的患病率)。这是由于其常染色体显性遗传，考虑到突变的htt基因的单拷贝足以在患者和实验模型两者中赋予病理表型。
4、该疾病是由亨廷顿蛋白(htt)基因中cag三联体的异常扩增(>36)引起的，导致含有polyq重复的突变体htt蛋白质的形成。野生型htt蛋白质在nh2末端包含9个至35个q残基，并且与神经管的形成、对凋亡刺激的抗性以及bdnf和相关基因的转录控制有关。事实上，编码多聚谷氨酰胺的cag三核苷酸重复序列扩增赋予突变体htt毒性功能获得活性，导致易于聚集的蛋白质的异常积累、对谷氨酸毒性的敏感性增加、线粒体损伤和转录程序的失调。然而，仍然很难知道哪些过程是早期的致病事件，并且哪些是后果。此外，htt蛋白质是遍在表达的，然而，hd的特征在于细胞群特异性损伤、基底神经节的纹状体中传出性中型多棘神经元的损失和皮质结构的大量变性。
5、尽管已经获得的所有关于hd发病机制的知识，但还没有有效的治疗干预。尽管缓解hd中受损的细胞过程在动物模型中给出了有希望的结果，但迄今为止所有的临床试验都没有展示出疗效。因此，对于在本领域中寻找用于治疗polyq疾病的不同治疗策略存在需求。
技术实现思路
0、发明概述
1、本发明的作者专注于鉴定因子，即能够降低引起polyq疾病的polyq突变蛋白质的毒性的治疗性蛋白质，即抵消由所述突变体polyq表达蛋白质引起的细胞死亡、氧化应激和/或转录改变。
2、本发明的作者已经鉴定出至少9种基因，当通过合适的基因治疗手段，诸如合适的病毒载体(例如aav载体)或以mrna的形式在体外和/或体内(在动物模型中)表达时，强烈缓解突变体htt基因的有害作用，从而提供了针对polyq疾病的新治疗策略。所述基因编码多肽分子，即蛋白质，在本文中被定义为“治疗性蛋白质”，当在表达一种或更多种引起polyq疾病的polyq突变蛋白质的细胞或动物中表达时，均具有降低由所述一种或更多种polyq突变蛋白质引起的细胞毒性的功能特征，从而降低引起polyq疾病的突变蛋白质的病理效应(下文表1)。
3、本发明涉及能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性的一种或更多种治疗性蛋白质，或编码所述一种或更多种治疗性蛋白质的核苷酸序列，用于在治疗所述疾病中使用，优选地通过基因治疗(本文旨在作为所述一种或更多种治疗性蛋白质的基因递送)。
4、因此，本发明涉及能够降低由atn1、htt、ar、atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp基因中的一种或更多种表达的突变蛋白质的毒性的一种或更多种治疗性蛋白质，其中所述蛋白质包含病理数量的polyq残基(如表1中报告的)，用于在例如通过基因治疗治疗polyq疾病中使用。
5、根据本发明，符合现有技术，polyq疾病是drpla(齿状核红核苍白球路易体萎缩)、hd(亨廷顿病)、sbma (脊髓延髓性肌萎缩)、sca1(脊髓小脑共济失调1型)、sca2(脊髓小脑共济失调2型)、sca3(脊髓小脑共济失调3型或马查多-约瑟夫病)、sca6(脊髓小脑共济失调6型)、sca7(脊髓小脑共济失调7型)、sca12(脊髓小脑共济失调12型)、sca17(脊髓小脑共济失调17型)。
6、根据本发明，基因治疗是一种治疗策略，其包括递送编码能够通过阻止或改变所述疾病的进展来治疗所述疾病的因子的核酸。
7、本发明的目的是
8、一种或更多种能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性的治疗性蛋白质，或编码所述一种或更多种治疗性蛋白质的核苷酸序列，用于在治疗所述疾病中使用，优选地通过基因治疗；
9、一种包含编码本文定义或要求保护的治疗性蛋白质、同种型或同源物的核苷酸序列的递送系统；
10、一种适用于基因治疗的表达载体或递送系统或载体、或腺相关病毒载体aav或慢病毒载体、或纳米颗粒、或lnp，包含编码能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性的治疗性蛋白质的一种或更多种cdna或rna序列；
11、一种cdna或mrna分子(游离的或与一种或更多种合适的运载体分子复合的)，编码能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性的治疗性蛋白质；
12、用于在治疗polyq疾病中使用的所述递送系统或表达载体或cdna分子或mrna分子(游离的或与一种或更多种合适的运载体分子复合的)；
13、一种治疗polyq疾病的方法，其包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的：
14、包含编码治疗性蛋白质的cdna或rna序列的递送系统、表达载体，所述治疗性蛋白质能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性，如说明书或权利要求中的任何实施方案所定义的，或
15、编码治疗性蛋白质的cdna或mrna分子(游离的或在合适的递送系统中的)，所述治疗性蛋白质能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性，如说明书或权利要求中的任何实施方案所定义的，或
16、治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性，如说明书和权利要求中的任何实施方案所定义的。
17、在本发明的所有目的中：
18、所述突变蛋白质由atn1、htt、ar、atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp基因中的一种或更多种表达，并且包含病理数量的polyq残基(如表1中报告的)；
19、所述一种或更多种治疗性蛋白质、其同种型或同源物能够降低由包含病理数量的polyq残基的atn1、htt、ar、atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp基因(如表1中报告的)中的一种或更多种表达的突变蛋白质的毒性；
20、所述一种或更多种治疗性蛋白质选自金属调节转录因子1(基因：mtf1-mtf1)、赖氨酸特异性去甲基化酶5b(基因：kdm5b-kdm5b)、赖氨酸特异性去甲基化酶2b(基因：kdm2b-kdm2b)、仅含f-盒蛋白34(f-box only protein 34，基因：fbx034-fbx034)、线粒体必需mcu调节因子(基因：smdt1-smdt1)、肝配蛋白a型受体4(基因：epha4-ephha4)、转导蛋白样增强子蛋白4(基因：tle4-tle4)、adp核糖基化因子结合蛋白-1(arfaptin-1，基因：arfip1-arfip1)和含有富含at的相互作用结构域的蛋白5b(基因：arid5b-arid5b)；
21、所述同种型或同源物保留了治疗性蛋白质(它们是如本文所定义的同种型或同源物)的降低引起特定polyq疾病的突变蛋白质的毒性的能力。
22、术语表
23、根据本说明书的基因治疗具有本领域中通常公认的含义，因此其是指通过遗传物质的转移(例如用健康拷贝替换突变基因，或使功能不正常的突变基因失活，或将新基因(诸如编码根据本发明的治疗性蛋白质的基因)引入体内)的治疗。在需要治疗的受试者中，即将核酸作为治疗疾病的药物治疗性递送到患者细胞中。根据本领域和本发明的基因治疗可以通过使用mrna分子或非病毒或病毒方法将感兴趣的遗传物质转移到需要治疗的受试者中来实现。通常被用于人类基因治疗的病毒表达载体包括逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和腺相关病毒。病毒载体基因组或者被整合到宿主的基因组中，或者作为附加体保留。
24、根据本说明书的腺相关病毒(aav)载体具有本领域中通常公认的含义。aav属于细小病毒。它是一种4.7kb大小的单链无包膜dna病毒，可引起人体细胞的潜伏感染。细小病毒代表恶性肿瘤相关逆转录病毒的可选物。已经从包括哺乳动物、鸟类和爬行动物在内的各种动物物种中分离出许多天然存在的aav血清型和变体。其中，常见的aav血清型包括aav1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。除了这些血清型之外，还有许多已被用于aav载体介导的基因递送的aav变体和突变体，包括aav-dj、aav-lk03、aav-php.b、aav-php.eb、aav-retro、aav2.7m 8等。
25、典型的aav载体包含两个itr(反向末端重复)区，并且在所述itr内至少包含以下元件：启动子、感兴趣的基因和终止子/多腺苷酸化信号。
26、根据本说明书的用于脑基因治疗的最佳血清型是指本领域中最熟知的更有效且适合用于脑基因治疗的aav血清型，即显示强神经向性的血清型。因此，根据本说明书，最佳血清型将是取决于用于治疗的靶脑细胞表现出最强的向性和感染效率的血清型。
27、根据本说明书的病毒颗粒表示含有核苷酸构建体的病毒衣壳，所述核苷酸构建体在引入合适的细胞时导致感兴趣的分子的表达，根据本发明的病毒颗粒在本领域中也被称为“基因转移载体”，并且包含含有将被转移到感染细胞中的遗传构建体的病毒衣壳。
28、根据本说明书的mrna分子是适合用于治疗的mrna分子，即包含位于编码序列侧翼的3’和5’utr元件、5’帽和poly a尾的分子。
29、根据本说明书，术语多聚谷氨酰胺疾病或polyq疾病是由三核苷酸重复序列扩增引起的遗传紊乱，三核苷酸的重复序列扩增是一种突变，其中三个核苷酸的重复序列(三核苷酸重复序列)的拷贝数增加，直到它们越过阈值，超过该阈值它们变得不稳定。polyq紊乱是由特定基因的蛋白质编码部分中的cag重复序列扩增引起的，在所有情况下，扩增的cag重复序列被翻译成不间断的谷氨酰胺残基序列，形成polyq束，并且polyq蛋白质的积累损害重要细胞功能。
30、本说明书中已知的polyq疾病如表1中描述的，并且包括drpla(齿状核红核苍白球路易体萎缩)、hd(亨廷顿病)、sbma(脊髓延髓性肌萎缩)、sca1(脊髓小脑共济失调1型)、sca2(脊髓小脑共济失调2型)、sca3(脊髓小脑共济失调3型或马查多-约瑟夫病)、sca6(脊髓小脑共济失调6型)、sca7(脊髓小脑共济失调7型)、sca12(脊髓小脑共济失调12型)、sca17(脊髓小脑共济失调17型)。
31、根据本说明书的polyq突变蛋白质是指由于编码所述蛋白质的基因中编码所述氨基酸的三联体相对于野生型蛋白质的扩增而包含异常数量(增加的)的q残基的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质是致病性的并引起polyq疾病。polyq突变蛋白质中的额外的q残基是额外的q残基的簇，其导致q残基链的数量相对于野生型蛋白质相关增加。polyq突变蛋白质中额外的q残基的平均数量是本领域已知的，实例报告于表1中。
32、根据本说明书的polyq突变蛋白质列于表1中。
33、在本说明书中，提及治疗性蛋白质或其同种型或同源物的表述“能够降低毒性”意指本发明的治疗性蛋白质对象在polyq疾病的模型动物或polyq疾病的模型细胞(即，表达引起polyq疾病的polyq突变体蛋白质的模型动物或细胞)中的表达，与当本发明的治疗性蛋白质对象不表达时所述模型的观察到的细胞死亡相比，减少所述模型中的细胞死亡；和/或与当本发明的治疗性蛋白质对象不表达时所述模型的观察到的氧化应激相比，减少所述模型中的氧化应激；和/或与当本发明的治疗性蛋白质对象不表达时所述模型的观察到的转录改变相比，减少所述模型中的转录改变。
34、根据本说明书，能够降低引起特定polyq疾病的突变蛋白质的毒性的治疗性蛋白质是在向有相应需要的受试者施用或通过基因治疗在所述受试者中表达后发挥治疗作用的蛋白质(即治疗性蛋白质)。
35、根据本说明书，表述“能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性”是指所述治疗性蛋白质或所述核苷酸序列的表达“在引入表达引起polyq疾病的突变蛋白质的哺乳动物细胞时或在施用至受polyq疾病影响的患者时，能够降低引起所述polyq疾病的所述突变蛋白质的毒性”。
36、根据本说明书，表述“polyq突变蛋白质的毒性”包括由所述突变体polyq表达的蛋白质引起的细胞死亡、氧化应激和转录改变。
37、引起polyq疾病的致病性突变蛋白质是包含呈表1中所示的polyq序列形式的增加数量的q残基的蛋白质。
38、在说明书和权利要求的任何部分中，表述“用于使用”在治疗中还涵盖说明书或权利要求中定义的一种或更多种治疗性蛋白质(包括同种型或同源物)、构建体、载体、mrna在制备用于所述治疗的药物中的用途，其中所述一种或更多种治疗性蛋白质(包括同种型或同源物)、构建体、载体、mrna与一种或更多种合适的赋形剂和/或运载体一起配制为可以施用用于治疗如本说明书中所示的polyq疾病的药物。
39、附图详述
40、图1-表达突变体htt的es细胞的建立和表征。a，通过dna转染和嘌呤霉素选择产生和表征表达突变体(128个cag重复序列)htt或野生型(15个cag重复序列)htt的n-末端片段的野生型es细胞(rex1gfp-d2)(分别被命名为q15和q128细胞)的实验策略。b，htt的蛋白质印迹证实了分别在q128和q15细胞中正确产生了80kda和65kda形式的htt蛋白。与q15 htt相比，q128 htt蛋白表达结果较低。使用gapdh作为上样对照。c，q128(橙色)和q15(蓝色)es细胞的增殖测定示出，由于突变体htt表达，细胞增殖明显受损。条形表示以点示出的6个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值。
41、d，通过碘化丙啶摄取和流式细胞术测量细胞死亡。与q15(蓝色)细胞相比，q128细胞(橙色)显示出更高的细胞死亡。计算每个样品的pi阳性细胞的分数(虚线)，并计算相对于q15样品的倍数变化。条形表示以点示出的4个独立实验的平均值±sem。代表性流式细胞术图在右侧示出。用单尾单样本mann-whitney u检验计算p值。e，测量2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(dcfda)中值荧光，作为q15(蓝色)与q128(橙色)细胞相比中活性氧产生的评估。条形表示以点示出的4个独立实验的平均值±sem。计算相对于q15样品的倍数变化。ros检测的代表性流式细胞术谱如右图所示。用单尾单样本mann-whitney u检验计算p值。f，q128和q15细胞的转录组分析。下调(log2倍数变化<0.5且p值<0.05)和上调(log2倍数变化>0.5且p值<0.05)的基因分别用蓝色和红色表示。突出了先前已知与亨廷顿病相关的基因。使用的阈值由虚线指示。用wald检验计算p值，无需调整。g，下调基因(左图，蓝色条形)和上调基因(右图，红色条形)的基因列表富集分析揭示了参与代谢(磷酸化、糖酵解)、蛋白酶体(细胞凋亡、泛素缀合)和一般转录的基因的统计学显著富集(p值＝0.05，以黑色虚线示出)。使用david数据库通过fisher精确检验计算p值.
42、图2-突变体htt毒性的抑制因子的功能获得筛选。a，上图：piggybac载体pgg134的图，该载体含有mscv 5’ltr，随后是来自小鼠foxf2基因的外显子1的剪接供体位点，导致整合位点侧翼的基因的激活。itr允许在ttaa位点随机整合，并且dsred-ires-潮霉素盒被用于鉴定具有稳定的载体整合的细胞。下图：用于鉴定涉及htt依赖性毒性的新蛋白的筛选策略的示意图。
43、将pgg134电穿孔转染(electroporate)到q128 es细胞中导致产生数千个独立突变体，每个突变体具有不同的过度激活基因。获得抗性的突变体被扩增并进一步表征，允许将基因鉴定为突变体htt毒性的新抑制因子。
44、b，在用所选化合物处理48小时后，通过定量结晶紫染色阳性集落对存活细胞的数量进行评分。巴佛洛霉素a和鱼藤酮在影响q15细胞存活的剂量对q128细胞没有影响，而mg132和他莫昔芬进一步降低了q128细胞的存活。条形表示至少2个独立实验的平均值±sem。将数据针对q15媒介物样品归一化。c，左图：用编码gfp的pb载体电穿孔转染的亲本es细胞(上图为亲本es_gfp)、用pb_gfp电穿孔转染的q128品系(中图为q128_gfp)和用pgg134载体电穿孔转染的q128细胞(下图为q128_pgg134)用mg132处理5天并用结晶紫染色的代表性图像。极少数q128_pgg134细胞在mg132处理后存活。右图：在存在mg132(左)或他莫昔芬(右)的情况下进行诱变和选择后，存活的q128_pgg134集落的cv信号强度与q128_gfp相比显著增加。条形表示以点示出的4个独立实验的平均值±sem。每个实验已针对pb_gfp载体归一化。用双尾单样本mann-whitney u检验计算p值。d，抗性克隆中整合位点的鉴定。左图上的凝胶电泳示出了来自突变体克隆mg15、mg16和mg17的sp-pcr产物。从凝胶上切下mg15中pb载体的5’端的相应扩增的单条带(红色虚方形)，纯化并测序。获得的序列(右上图)包括基因组dna的一部分，随后是bstyi限制性位点(gatc序列)和衔接子序列。然后将基因组序列与小鼠基因组比对，允许鉴定每个突变体细胞系中的精确整合位点。在此，发现pb载体插入到kdm5b基因的上游(下图)。e，通过qpcr对synj2、kdm5b、mtf1、fbxo34和arid1b基因的表达分析证实，与亲本和q128细胞系两者相比，这样的候选靶在相应克隆中的表达上调。条形表示以点示出的3个技术重复的平均值±sem。将表达针对最高值归一化。
45、f，q128细胞和5个选自q128_pgg134突变体群体的克隆的代表性结晶紫染色图像(左图)。所有克隆对外源性应激物均具有抗性，而大多数q128细胞死亡，并且亲本es细胞存活。
46、g，在用mg132或他莫昔芬处理48小时后分析中所有5个克隆中结晶紫信号的强度(示出了mg132，图8c中示出了他莫昔芬)。将数据针对q128_gfp1归一化。条形表示以点示出的2个独立实验的平均值±sem。
47、图3-突变体htt抑制因子的二次验证。a，通过在q128细胞中稳定表达携带在组成型cag启动子控制下的候选基因cdna的载体来进行二次验证实验的示意图。空载体(ev)和含有mcherry cdna的载体用作阴性对照。b，通过mtf1、kdm2b、kdm5b和fbxo34的qpcr基因表达分析证实了过表达它们的相应细胞系中基因的水平增加。条形表示以点示出的3个独立实验(mtf1、fbxo34、kdm2b)和2个独立实验(kdm5b)的平均值±sem。将表达针对最高值归一化。c，蛋白质印迹分析示出了突变体htt蛋白在用不同构建体转染的q128细胞中以相当的水平存在。使用gapdh作为上样对照。未裁剪的凝胶在源数据文件中提供。d、指定细胞系的增殖测定。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值，将每个候选物与q128_ev样品进行比较。
48、e，结晶紫定量示出了与亲本和q128细胞系两者相比，用mg132(左图)或他莫昔芬(右图)处理48小时后的128_mtf1、q128_kdm5b和q128_fbxo34细胞的存活集落的数量。mtf1显著改善了细胞对突变体htt的抗性，而在过表达其他候选物时观察到轻度影响。条形表示源数据文件中报告的单个实验的2次技术重复的平均值(在另外的2次实验中观察到相同的趋势)。
49、图4-mtf1调节hd相关基因。a，由mtf1拯救的差异表达基因。在q15和q128之间的552个deg中(图1f)，181个基因(粉红色)被mtf1过表达拯救(q128_mtf1与q128_ev之间的p值>＝0.05并且q128_mtf1与q128_ev之间log2fc>|0.5|)。b，示出了mtf1过表达对q128和q15细胞之间552个deg的拯救作用的热图。对于每个细胞系(q15、q128和q128_mtf1)，示出了基于行缩放表达值(每百万计数)计算的z评分。红色和蓝色分别表示高表达和低表达。突出了hd相关基因dpf1、prnp和ube2cbp。c，与q128细胞相比的q128_mtf1的转录组分析。下调(log2倍数变化<0.5且p值<0.05)和上调(log2倍数变化>0.5且p值<0.05)的基因分别用蓝色和红色表示。mt1和mt2以及mtf1本身被突出为最显著上调的基因。使用的阈值由虚线表示。用wald检验计算p值，无需调整。d，q128细胞中由mtf1过表达诱导的转录反应的基因列表富集分析。黑色虚线等于p值＝0.05。使用david数据库通过fisher精确检验计算p值。e、用空载体(q15_ev)或用编码mtf1(q15_mtf1)的质粒转染的q15细胞的增殖测定。未观察到mtf1过表达后细胞增殖率的显著变化。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值。f，通过碘化丙啶摄取和流式细胞术测量细胞死亡。染色揭示了，与q128(橙色)细胞相比，q128_mtf1(绿色)过表达减少了细胞死亡。计算每个样品的pi阳性细胞的分数(虚线)，并计算相对于q15样品的倍数变化。条形表示以点示出的2个独立实验的平均值±sem。代表性流式细胞术图在右侧示出。g，2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(dcfda)中值荧光的测量作为活性氧产生的评估。128_mtf1(绿色)的过表达能够减少表达突变体htt的细胞中ros的产生。条形表示以点示出的2个独立实验的平均值±sem。计算相对于q15样品的倍数变化。ros检测的代表性流式细胞术谱如右图所示。源数据以源数据文件提供。h，通过qpcr进行的基因表达分析证实了q128_mtf1细胞(绿色)中mt1和mt2基因的强烈上调。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值。将表达针对最高值归一化。
50、图5-在斑马鱼中mtf1抵消突变体htt效应。a，将包含16个或74个cag重复序列的亨廷顿蛋白(htt)外显子1编码序列克隆到pcs2质粒中，与egfp编码序列同框(in frame)融合。体外转录后，将q16egfp和q74egfp mrna注射到单细胞阶段胚胎的卵黄中。受精后24小时(hpf)，收集胚胎进行表型和分子分析。b，注射q16egfp+mcherry、q74egfp+mcherry或q74egfp+mtf1(250pg/胚胎+250pg/胚胎)的24小时阶段胚胎的代表性图像，用吖啶橙染色。上图：明场图像示出了胚胎的形态受到q74egfp+mcherry mrna注射的影响。下图：荧光显微术示出了在注射q74egfp+mcherry后吖啶橙阳性病灶(白色箭头)增加。图像是前部在上的侧视图。c，在以点示出的8个独立注射实验中在24hpf计数的死亡、畸形(重度或轻度)和健康胚胎的百分比。对q16+mcherry、q74+mcherry和q74+mtf1样品分别分析了共407个、511个和621个胚胎。箱形图表示第一、第二和第三个四分位数(quartile)；须状线表示最小值和最大值。用非配对双尾mann-whitney u检验计算p值。d，通过qpcr对显微注射egfp和q74+mtf1 mrna的斑马鱼胚胎进行egfp基因表达分析。条形表示以点示出的4个独立实验的平均值±sem。将表达针对最高值归一化。e，来自注射了q16+mcherry或q74+mcherry或q74+mtf1的两个独立实验的30小时阶段胚胎的tunel测定的代表性图像。对每个胚胎扫描多个焦平面，跨越前部结构的整个深度，并在明场和荧光通道上获得z投影。由于在这个发育阶段发生的生理性凋亡依赖性重塑，注射q16+mcherry的胚胎显示出一些基础tunel阳性。f，tunel阳性面积占总面积(不包括卵黄区域)的百分比的定量。每个点代表一个胚胎(q16+mcherry＝15，q74+mcherry＝14，q74+mtf1＝17)。箱形图表示第一、第二和第三个四分位数；须状线表示最小值和最大值。畸形和健康胚胎的百分比分别以红色和绿色示出。健康胚胎的特征在于tunel信号降低。
51、图6-mtf1等位基因的aav-载体递送减轻r6/2小鼠的运动缺陷。a，在注射了包装有mtf1或gfp的aav的hd小鼠模型中进行运动行为测试的实验策略的示意图。在4周龄时进行尾静脉注射。通过水平梯任务和转棒测试评估运动表现。b，gfp的蛋白质印迹证实了尾静脉注射含gfp的aav的四周龄r6/2小鼠的脑裂解物中的病毒表达，并因此证实了aav穿过脑血屏障的能力。注射aav-mtf1的小鼠被用作阴性对照。使用act b作为上样对照。
52、c，注射aav-mtf1改善r6/2小鼠的运动功能(红色线)。通过转棒测试评估的运动表现考虑跌落的潜伏期时间：注射aav-gfp载体的r6/2小鼠比注射aav-mtf1的野生型同窝鼠和r6/2小鼠跌落得更快。箭头指示治疗何时开始。上图：线图示出了每个实验组在每个时间点的平均值+/-标准偏差。下图：11周龄时所示实验组的箱形图。箱形图表示第一、第二和第三个四分位数；须状线表示最小值和最大值。对于每组，注射的小鼠数量以点示出(wt aav-gfp＝8；wt aav-mtf1＝9；r6/2aav-gfp＝9；r6/2aav-mtf1＝10)。使用具有bonferroni校正的非配对双尾mann-whitney u检验计算p值。d，水平梯任务上的运动协调分析。与注射aav-gfp载体的r6/2小鼠(黑色虚线)相比，注射aav-mtf1的r6/2小鼠(红色线)的总误差分数较低，尤其是在当症状出现的晚期周龄。箭头指示治疗何时开始。箱形图表示第一、第二和第三个四分位数；须状线表示最小值和最大值。对于每组，注射的小鼠数量以点示出(wt aav-gfp＝8；wt aav-mtf1＝8；r6/2aav-gfp＝9；r6/2aav-mtf1＝10)。使用具有bonferroni校正的非配对双尾mann-whitney u检验计算p值。e，注射aav-gfp或aav-mtf1病毒后r6/2和wt小鼠的平均体重。箱形图表示第一、第二和第三个四分位数；须状线表示最小值和最大值。对于每组，注射的小鼠数量以点示出(wt aav-gfp＝8；wt aav-mtf1＝9；r6/2aav-gfp＝9；r6/2aav-mtf1＝10)。使用具有bonferroni校正的非配对双尾mann-whitney u检验计算p值。f，对总dna的pcr证实了mtf1在大脑皮层和纹状体组织两者中的有效体内脑递送。act b被用作pcr反应的阳性对照。
53、图7-表达突变体htt的es细胞的建立和表征。a，与亲本es品系(rex1gfp-d2)相比，通过qpcr分析q15(蓝色)和q128(橙色)细胞中htt基因(左图)和多能性标志物oct4、sox2和nanog(右图)的基因表达。条形表示以点示出的2个(对于nanog)、3个(对于htt)或4个(对于oct4和sox2)独立实验的平均值±sem(平均值的标准误差)。结果显示，两个hd品系的httmrna的表达水平相似地升高，并且在背景中保留了多能性特征。将表达针对最高值归一化。b，与亲本es品系相比，通过qpcr对表达q15(蓝色)或q128(橙色)构建体的野生型小鼠es细胞(e14tg2a)中的htt基因进行基因表达分析。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。结果显示，两个hd品系的htt mrna的表达水平相似地升高。将表达针对最高值归一化。c，htt的蛋白质印迹证实了分别在e14_q128和e14_q15细胞中正确产生80kda和65kda形式的htt蛋白。使用gapdh用作上样对照。d，e14_q128(橙色)和e14_q15(蓝色)es细胞的增殖测定显示，由于突变体htt表达，细胞增殖明显受损。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值。e，通过碘化丙啶摄取和流式细胞术测量细胞死亡。与e14_q15(蓝色)细胞相比，e14_q128(橙色)细胞展现出更高的细胞死亡。条形表示以点示出的4个独立实验的平均值±sem。计算相对于q15样品的倍数变化。用单尾单样本mann-whitney u检验计算p值。源数据以源数据文件提供。f，测量2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(dcfda)荧光作为e14_q15(蓝色)与e14_q128(橙色)细胞相比中活性氧产生的评估。条形表示以点示出的四个独立实验的平均值±sem。计算相对于q15样品的倍数变化。用单尾单样本mann-whitney u检验计算p值。
54、图8-突变体htt毒性的抑制因子的功能获得筛选。a，在用指定化合物处理48小时后，通过结晶紫染色定量存活亲本es细胞的数量。条形表示2个独立实验的平均值±sem。将数据针对用媒介物处理的细胞归一化。b，通过对收集的所有mg或他莫昔芬克隆的sp-pcr和pcr条带分析鉴定出的靶基因的列表。对于(所收集的44个中的)9个克隆，由于技术限制，我们无法鉴定整合位点，诸如多个整合位点或未能检测到任何信号。c，结晶紫定量示出了在用他莫昔芬处理48小时后分析的所有5个克隆中存活集落的数量。将数据针对q128对照归一化。条形表示以点示出的2个独立实验的平均值±sem。d，qpcr分析示出了在所有克隆以及q128 htt es细胞中htt mrna的相似的高表达水平，证实了在筛选过程中q128 mrna没有被沉默。条形表示以点示出的3个技术重复的平均值±sem。将表达针对最高值归一化。
55、e，蛋白质印迹证实了htt蛋白仍然存在于所有克隆中。使用gapdh作为上样对照。每个克隆下面示出的值是针对gapdh强度归一化的htt强度的平均值(3次技术重复)。
56、图9-突变体htt毒性的候选抑制因子的网络分析。
57、a，对从ngs筛选中鉴定出的基因的基因列表富集分析揭示了与蛋白酶体降解(例如泛素缀合，p值＝9.77e-04)或囊泡运输(例如乙酰化，p值＝0.005)和转录调节因子(例如甲基化，p值＝0.001)相关的类别的统计学显著富集。使用david数据库通过fisher精确检验计算p值。
58、图10-突变体htt抑制因子的二次验证。a，对htt mrna的qpcr分析示出了htt表达不受候选基因的共表达的影响。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。将表达针对最高值归一化。
59、图11-mtf1调节hd相关基因。a，用空载体(e14_ev)或用mtf1编码质粒(e14_mtf1)转染的e14细胞的增殖测定。未观察到mtf1过表达后细胞增殖率的显著变化。条形表示以点示出的3个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值。
60、图12-在斑马鱼中mtf1抵消突变体htt效应。a，与未注射的对照(左图)相比，注射q74egfp mrna(250pg/胚胎，右图)的24小时阶段胚胎通过荧光显微术获得的代表性图像。虚线表示感兴趣的区域，而卵黄(y)显示自发荧光。注射q74egfp mrna的胚胎沿整个胚胎表现出荧光信号。b，在注射递增剂量的q74egfp mrna(范围为150pg/胚胎至1000pg/胚胎)后获得的在24hpf进行表型评分的死亡、畸形和健康胚胎的百分比。高于500pg/胚胎的剂量对胚胎有高度毒性，导致许多鱼死亡，而低于500pg/胚胎的剂量更加耐受。250pg/胚胎的剂量显示出最高的畸形率和最低的死亡水平，并且因此选择其用于以下实验。每个点代表一个独立的实验。
61、图13用空载体(q128_ev)或用编码以下候选治疗基因的质粒转染的q128细胞的增殖测定：arid5b(q128_arid5b)、smdt1(q128_smdt1)、epha4(q128_epha4)、tle4(q128_tle4)、arfip1(q128_arfip1)。
62、通过在存在6μg/ml嘌呤霉素的情况下将30,000个es细胞接种于12孔板中来评估细胞增殖。每24小时计数一次细胞，持续4天。
63、观察到每种候选基因的过表达对细胞增殖率的显著拯救。条形表示以点示出的arid5b、tle4、arfip1的3个独立实验和smdt1、epha4的5个独立实验的平均值±sem。用双向重复测量anova计算p值，将每个候选物与q128_ev样品进行比较。
1.一种治疗性蛋白质或其同种型或同源物，所述同源物具有序列同源性，所述序列同源性被定义为与所述治疗性蛋白质具有至少55％覆盖率和至少49％同一性，其中所述治疗性蛋白质、其同种型或同源物能够降低引起polyq疾病的突变蛋白质的毒性，用于在治疗所述疾病中使用。
2.根据权利要求1所述的用于使用的治疗性蛋白质或其同种型或同源物，其中所述突变蛋白质由atn1、htt、ar、atxn1、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp基因中的一种或更多种表达，所述突变蛋白质包含病理数量的polyq残基。
3.根据权利要求1或2所述的用于使用的治疗性蛋白质，其中所述治疗性蛋白质选自金属调节转录因子1、赖氨酸特异性去甲基化酶5b、赖氨酸特异性去甲基化酶2b、仅含f-盒蛋白34、线粒体必需mcu调节因子、肝配蛋白a型受体4、转导蛋白样增强子蛋白4、adp核糖基化因子结合蛋白-1、含有富含at的相互作用结构域的蛋白5b。
4.根据权利要求1或2所述的用于使用的治疗性蛋白质同种型，其中所述同种型选自下表3
5.根据权利要求1或2所述的用于使用的治疗性蛋白质同源物，其中所述同源物选自下表4
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于使用的治疗性蛋白质、其同种型或同源物，其中所述polyq疾病是齿状核红核苍白球路易体萎缩、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型或脊髓小脑共济失调17型。
7.一种适用于基因治疗的表达载体或递送系统或载体，或腺相关病毒载体aav或慢病毒载体，或纳米颗粒，或lnp，包含编码权利要求1至5中定义的治疗性蛋白质、其同种型或同源物的核苷酸序列。
8.根据权利要求9至11中任一项所述的载体，其中所述载体是具有用于cns基因治疗的最佳衣壳血清型的病毒载体aav。
9.根据权利要求7或8中任一项所定义的适用于基因治疗的表达载体或递送系统或载体、或腺相关病毒载体aav或慢病毒载体、或纳米颗粒、或lnp或核苷酸序列，用于在治疗polyq疾病中使用。
10.根据权利要求9所述的用于使用的适用于基因治疗的表达载体或递送系统或载体、或腺相关病毒载体aav或慢病毒载体、或纳米颗粒、或lnp或核苷酸序列，其中所述polyq疾病是齿状核红核苍白球路易体萎缩、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型或脊髓小脑共济失调17型。
11.一种病毒颗粒，包含病毒衣壳和编码权利要求1至5中任一项所定义的治疗性蛋白质或其同种型或同源物的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的病毒颗粒，用于在polyq疾病的基因治疗治疗中使用。
13.根据权利要求12所述的用于使用的病毒颗粒，其中所述polyq疾病是齿状核红核苍白球路易体萎缩、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型或脊髓小脑共济失调17型。
14.一种mrna，所述mrna编码权利要求1至5所定义的治疗性蛋白质、其同种型或同源物。
15.根据权利要求14所述的mrna，其中所述mrna与一种或更多种运载体分子复合。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的mrna，其中所述mrna复合在阳离子纳米乳液中、在纳米颗粒中、在脂质体中、在阳离子聚合物脂质体中、在多糖颗粒中、在阳离子脂质纳米颗粒中、在阳离子脂质胆固醇纳米颗粒中、在阳离子脂质胆固醇peg纳米颗粒中。
17.根据权利要求14至16中任一项所定义的mrna，用于在治疗polyq疾病中使用。
18.根据权利要求17所述的用于使用的mrna，其中所述polyq疾病是齿状核红核苍白球路易体萎缩、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型或脊髓小脑共济失调17型。
19.一种药物组合物，包含权利要求1至5中定义的治疗性蛋白质、其同种型或同源物，或权利要求7-9中任一项所述的适用于基因治疗的表达载体或递送系统或载体，或腺相关病毒载体aav或慢病毒载体，或纳米颗粒，或lnp或核苷酸序列，或权利要求11所述的病毒颗粒或权利要求14至16中任一项所述的mrna和药学上可接受的运载体。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，用于在治疗polyq疾病中使用。
21.根据权利要求35所述的用于使用的药物组合物，其中所述polyq疾病是齿状核红核苍白球路易体萎缩、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调12型或脊髓小脑共济失调17型。
