本发明涉及选择表达具有高水平的正确组装的蛋白质的多特异性结合分子(诸如抗体，特别是双特异性抗体)的细胞的方法。
背景技术：
1、双特异性抗体作为一种治疗方法已经示出了很大的前景：双特异性抗体正在以创纪录的数量进入临床研究，其中大多数是针对癌症而开发的。与自然存在的igg分子不同，此类分子含有至少2条且通常至少4条不同的链(例如，两条重链和两条轻链)。因此，完整产品的组装有多种不同的排列，而自然存在的igg分子仅有一种。
2、已经提出了许多解决方案来解决这些链配对问题。杵入臼(knob into holes)通常用于指导重链-重链配对。已使用多种技术来指导重链-轻链配对，诸如crossmabs方法。尽管如此，仍然需要选择有效表达双特异性的克隆生产细胞系，其中已实现高水平的正确组装并且在下游处理期间可以容易地将正确配对的分子与不正确配对的分子分开。本发明满足了这一需要。
3、多特异性治疗分子与癌细胞上的至少两种不同抗原结合，并将至少一种效应细胞(nk细胞或t细胞)募集到肿瘤位点。因此，用于生成此类复杂分子的蛋白质工程工具涉及多条多肽链的复杂设计，这些多肽链需要以正确的比率汇聚在一起以形成全功能多特异性分子。这对细胞机制提出了重大挑战。
4、在本公开中，我们还描述了一种确定三特异性分子的正确组装的方法(例如：igg分子与癌细胞上的her1(抗原1)、her2(抗原2)结合，并通过与t细胞受体上的cd3(抗原3)结合的scfv募集t细胞)，该方法使用例如in-beacon测定和基于板的测定。
技术实现思路
1、本发明提供了一种使得能够在生长和分泌重组蛋白的同时在体外分析单个细胞克隆的方法。通过使用与产物的正确配对区域特异性结合的试剂，可以评估和比较不同的生产克隆，以使得能够选择有效生产正确形成的产物与不正确形成的产物的改进比率的细胞。
2、因此，在第一方面中，本发明提供了一种选择用于表达多特异性结合分子的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
3、(a)提供宿主细胞群，这些宿主细胞
4、(i)包含编码至少两种多肽的一个或多个核酸序列，
5、其中多肽由宿主细胞表达；并且其中第一多肽形成靶分子的第一结合位点，并且第二多肽形成靶分子的第二结合位点，该第二结合位点不同于第一结合位点；或者
6、(ii)包含编码至少四种多肽的一个或多个核酸序列，
7、其中多肽由宿主细胞表达，
8、并且其中第一多肽和第三多肽一起形成靶分子的第一结合位点，并且第二多肽和第四多肽一起形成靶分子的第二结合位点，该第二结合位点不同于第一结合位点；并且
9、(b)使宿主细胞与(i)选择性结合第一结合位点的第一标记试剂，和(ii)选择性结合第二结合位点的第二标记试剂接触；
10、(c)测量与它们各自的结合位点结合的第一标记试剂和第二标记试剂的水平；并且
11、(d)基于步骤(c)中测量的两种水平的比较来选择表达多特异性结合分子的一个或多个宿主细胞。
12、在另一方面中，本发明提供了一种选择用于表达多特异性结合分子的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
13、(a)提供宿主细胞群，这些宿主细胞包含编码至少两种多肽的一个或多个核酸序列，
14、其中多肽由宿主细胞表达；并且
15、其中第一多肽形成靶分子的第一结合位点，并且第二多肽形成靶分子的
16、第二结合位点，该第二结合位点不同于第一结合位点；
17、(b)使宿主细胞与(i)选择性结合第一结合位点的第一标记试剂，和(ii)选择性结合第二结合位点的第二标记试剂接触；
18、(c)测量与它们各自的结合位点结合的第一标记试剂和第二标记试剂的水平；并且
19、(d)基于步骤(c)中测量的两种水平的比较来选择表达多特异性结合分子的一个或多个宿主细胞。
20、在进一步的方面中，本发明涉及一种选择用于表达多特异性结合分子的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
21、(a)提供宿主细胞群，这些宿主细胞包含编码至少四种多肽的一个或多个核酸序列，
22、其中多肽由宿主细胞表达，并且
23、其中第一多肽和第三多肽一起形成靶分子的第一结合位点，并且第二多肽和第四多肽一起形成靶分子的第二结合位点，该第二结合位点不同于
24、第一结合位点；
25、(b)使宿主细胞与(i)选择性结合第一结合位点的第一标记试剂，和(ii)选择性结合第二结合位点的第二标记试剂接触；
26、(c)测量与它们各自的结合位点结合的第一标记试剂和第二标记试剂的水平；并且
27、(d)基于步骤(c)中测量的两种水平的比较来选择表达多特异性结合分子的一个或多个宿主细胞。
28、在一个实施例中，第三和第四多肽是相同的。
29、在一个实施例中，宿主细胞包含编码至少两种或至少四种多肽的相同的一个或多个核酸序列。
30、在一个实施例中，多特异性结合分子由宿主细胞分泌。
31、在一个实施例中，多特异性结合分子是多特异性抗体或双特异性抗体。
32、在一个实施例中，第一和/或第二标记试剂包含多特异性结合分子的靶抗原。
33、在一个实施例中，第一和第二试剂的标记不同。
34、在一个实施例中，第一和/或第二标记试剂是荧光标记试剂。
35、在一个实施例中，第一和/或第二标记试剂是抗独特型抗体-荧光团缀合物。
36、在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
37、在一个实施例中，宿主细胞在约0.3纳升与约500微升之间的体积中培养。
38、在一个实施例中，宿主细胞在微板中或在流体装置中培养。
39、在一个实施例中，宿主细胞在微流体装置中培养，可选地其中微流体装置包括与多个隔离栏流体连接的微流体通道，可选地其中宿主细胞被装载到微流体装置中使得多个隔离栏各自装载有一个宿主细胞。
40、在一个实施例中，该方法进一步包括：在允许表达至少两种不同的多肽并组装成多特异性结合分子的条件下培育根据步骤(d)选择的宿主细胞，并分离多特异性结合分子。
41、在一方面中，本发明涉及一种在宿主细胞中表达多特异性结合分子的方法，该方法包括在允许表达至少两种不同的多肽并组装成多特异性结合分子的条件下培育根据本文所描述的方法选择的宿主细胞，并分离多特异性结合分子。
42、在进一步的方面中，本发明涉及通过在宿主细胞中表达本文所描述的多特异性结合分子的方法制备的多特异性结合分子。
1.一种选择用于表达多特异性结合分子的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1(a)(ii)所述的方法，其中所述第三和第四多肽是相同的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述至少两种或至少四种多肽的相同的一个或多个核酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子由所述宿主细胞分泌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合分子是多特异性抗体或双特异性抗体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标记试剂包含所述多特异性结合分子的靶抗原。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二试剂的标记不同。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标记试剂是荧光标记试剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标记试剂是抗独特型抗体-荧光团缀合物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在约0.3纳升与约500微升之间的体积中培养。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在微板中或在流体装置中培养。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞在微流体装置中培养，可选地其中所述微流体装置包括与多个隔离栏流体连接的微流体通道，可选地其中所述宿主细胞被装载到所述微流体装置中使得多个所述隔离栏各自装载有一个宿主细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在允许表达至少两种不同的多肽并组装成多特异性结合分子的条件下培育根据步骤(d)选择的宿主细胞，并分离所述多特异性结合分子。
15.一种通过根据权利要求14所述的方法制备的多特异性结合分子。
