本发明一般涉及重组蜘蛛丝蛋白，特别是可产生具有改良的机械特性的丝纤维的重组蜘蛛丝蛋白。
背景技术：
1、蜘蛛可以吐出七种类型的丝，每种都有独特的机械特性，由不同的腺体产生：大壶状腺丝、小壶状腺丝、鞭状腺丝、管状腺丝、葡萄状腺丝、聚状腺丝和梨状腺丝。这些丝由丝蛋白制成，这些丝蛋白根据其主要表达腺体命名，分别为大壶状腹蜘蛛丝蛋白(masp)、小壶状腹蜘蛛丝蛋白(misp)、鞭状腺蜘蛛丝蛋白(flsp)、管状腺蜘蛛丝蛋白(tusp)、葡萄状腺蜘蛛丝蛋白(acsp)、聚状腺蜘蛛丝蛋白(agsp)和梨状腺蜘蛛丝蛋白(pisp)。所有蜘蛛丝蛋白(在本领域中也称为蛛丝蛋白)均具有n端(nt)结构域、广泛重复区(rep)和c端(ct)结构域。认为机械特性是由rep结构域决定的(guerette等人,science 11:112-115(1996))。最具延展性的纤维是鞭状腺丝，主要由携带富含pro的rep区的蜘蛛丝蛋白(flsps)制成，预计其会形成类似弹簧的结构。最强的纤维是大壶状腺丝，也称为拖丝，主要由携带迭代的富含gly和聚-ala重复序列的重复区域的蜘蛛丝蛋白(masps)组成。大壶状腺丝的拉伸强度来自于在丝纤维中形成β-片状晶体的masp聚-ala嵌段，而富含gly的部分则介导纤维的延展性(bratzel等人,j mech behav biomed mater.7:30-40(2012)；liu等人,adv functmater.26:5534-5541(2016)；keten等人,nat mater.9:359-367(2010))。masp丝是已知的最坚韧的天然纤维(约150mj/m3)(gosline等人,j exp biol 202:3295-3303(1999)；blackledge等人,j exp biol 209:2452-2461(2006))。
2、本领域已知一种重组蜘蛛丝蛋白，其在水中的溶解度得到改良，从而允许以高产量进行大规模生产，其为nt2repct(wo 2018/002216；andersson等人,nat chem biol 11:309-315(2017))。nt2repct含有his6标签、来自苗圃织网蜘蛛(euprosthenops australis)masp1的nt结构域、来自苗圃织网蜘蛛(e.australis)的两个富含gly和聚-ala的串联重复序列(2rep)以及来自大腹园蛛(araneus ventricosus)misp的ct结构域。
3、johansson及rising,acs nano 15:1952-1959(2021)公开了一种基于结构生物学的方法，用于设计人工蛛丝以产生具有改良的机械特性的仿生丝纤维。
4、然而，仍然需要一种能够产生具有改良的机械特性的丝纤维的重组蜘蛛蛋白。
技术实现思路
1、总体目标是提供一种能够产生具有改良的机械特性的丝纤维的重组蜘蛛丝蛋白。
2、本发明的实施方案满足这一目标和其它目的。
3、本发明在独立权利要求中限定。在从属权利要求中限定本发明的其它实施方案。
4、本发明的一个方面涉及一种重组蜘蛛丝蛋白，其包含n端(nt)结构域、重复区(rep)结构域和c端(ct)结构域。rep结构域包含一组根据式pa1-pg-pa2的结构域。pg代表富含甘氨酸的结构域，pa1和pa2代表富含丙氨酸的结构域。pa1和pa2中的一个是聚丙氨酸结构域，并且pa1和pa2中的另一个是每第三个或第四个丙氨酸残基被异亮氨酸残基或缬氨酸残基替换的聚丙氨酸结构域。
5、本发明的其它方面涉及由根据上文的重组蜘蛛丝蛋白制成的丝纤维、包含根据上文的丝纤维的合成材料、编码根据上文的重组蜘蛛丝蛋白的核酸分子、包含根据上文的核酸分子的表达载体以及包含根据上文的表达载体的宿主细胞。
6、本发明的另一方面涉及一种产生丝纤维的方法。所述方法包括将包含根据上文的重组蜘蛛丝蛋白的纺丝原液挤压到具有酸性ph的水性缓冲液中，以诱导重组蜘蛛丝蛋白聚合成丝纤维。所述方法还包括将丝纤维从水性缓冲液中分离。
7、本发明的重组蜘蛛丝蛋白可以纺成具有非常高的拉伸强度和断裂应变以及与天然拖丝相当的韧性的丝纤维。本发明的重组蜘蛛丝蛋白还可以高产量生产并浓缩到高浓度以生产适用于生产丝纤维的纺丝原液。
1.一种重组蜘蛛丝蛋白，所述重组蜘蛛丝蛋白包含n端(nt)结构域、重复区(rep)结构域和c端(ct)结构域，其中
2.如权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中pa1和pa2中的一个包含氨基酸序列am，优选由所述氨基酸序列组成，其中m是在7至18的区间内选择的整数，优选地在10至17的区间内选择的整数，更优选地在14至16的区间内选择的整数。
3.如权利要求1或2所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中pa1和pa2中的另一个是每第四个丙氨酸残基被异亮氨酸残基或缬氨酸残基替换的聚丙氨酸结构域，优选为每第四个丙氨酸残基被异亮氨酸残基替换的聚丙氨酸结构域。
4.如权利要求3所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中pa1和pa2中的另一个包含选自由(a3i)nap、ap(ia3)n、(a3v)nap和ap(va3)n组成的组，优选地选自由(a3i)nap和ap(ia3)n组成的组，更优选地为(a3i)nap的氨基酸序列，优选地由所述氨基酸序列组成，其中n是在2至4的区间内选择的整数，优选地为3，p＝m–n，并且m是在8至18的区间内选择，优选地在10至17的区间内选择，更优选地在14至16的区间内选择的整数。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中
6.如权利要求5所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述rep结构域包含一组根据选自由以下组成的组的式的结构域：(a3i)3a3-pg1-a14-pg2、a15-pg1-(a3i)3a2-pg2、pg1-(a3i)3a3-pg2-a14、pg1-a15-pg2-(a3i)3a2、pg1-(a3i)3a3-pg2-a14-pg3、pg1-a15-pg2-(a3i)3a2-pg3、(a3v)3a3-pg1-a14-pg2、a15-pg1-(a3v)3a2-pg2、pg1-(a3v)3a3-pg2-a14、pg1-a15-pg2-(a3v)3a2、pg1-(a3v)3a3-pg2-a14-pg3和pg1-a15-pg2-(a3v)3a2-pg3，优选地选自由(a3i)3a3-pg1-a14-pg2、a15-pg1-(a3i)3a2-pg2、pg1-(a3i)3a3-pg2-a14、pg1-a15-pg2-(a3i)3a2、pg1-(a3i)3a3-pg2-a14-pg3和pg1-a15-pg2-(a3i)3a2-pg3组成的组，更优选地选自由pg1-(a3i)3a3-pg2-a14-pg3和pg1-a15-pg2-(a3i)3a2-pg3组成的组，并且甚至更优选为pg1-(a3i)3a3-pg2-a14-pg3。
7.如权利要求5或6所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中pg1、pg2和pg3中的每一者包含选自由seq id no:49至51组成的组的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成，优选地pg1包含根据seq id no:49的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成，pg2包含根据seq id no:50的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成，并且pg3包含根据seq id no:51的氨基酸序列，优选由所述氨基酸序列组成。
8.如权利要求5至7中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述rep结构域由一组根据选自由以下组成的组的式的结构域组成：pa1-pg1-pa2-pg2、pg1-pa1-pg2-pa2和pg1-pa1-pg2-pa2-pg3，优选为pg1-pa1-pg2-pa2-pg3。
9.如权利要求1至8中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白中所述rep结构域排列在所述nt结构域与所述ct结构域之间。
10.如权利要求9所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白具有通式(x)-nt-(l1)-rep-(l2)-ct-(y)，其中x代表任选的n端标签，y代表任选的c端标签，l1代表任选的第一接头，并且l2代表任选的第二接头。
11.如权利要求1至10中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述nt结构域来源于苗圃织网蜘蛛masp1的nt结构域，优选地其中所述nt结构域包含seq id no:53，优选地由seq idno:53组成。
12.如权利要求1至11中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述ct结构域来源于大腹园蛛misp的ct结构域，优选地其中所述ct结构域包含seq id no:54，优选地由seq id no:54组成。
13.一种丝纤维，所述丝纤维由如权利要求1至12中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白制成。
14.一种合成材料，所述合成材料包含根据权利要求13所述的丝纤维。
15.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1至12中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白。
16.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求16所述的表达载体。
18.一种产生丝纤维的方法，所述方法包括：
