发明领域本发明涉及改进的方法，该方法使用开放式微灌注(open flow micro-perfusion)(ofm)组合扩散池装置(特别是静态franz扩散池(fdc))来表征化合物(例如活性药物成分(api))通过皮肤的扩散。这些方法是使用皮肤外植体的体外方法。发明背景当前的医疗产品开发路径变得越来越具有挑战性、效率低下且成本高昂。美国食品药品管理局(fda)认为，“尚未开展足够的应用科学工作来创建新工具，以便从根本上更好地回答如何以更快的时间范围、更高的确定性和更低的成本证明新产品的安全性和有效性。在许多情况下，开发人员别无选择，只能使用上个世纪的工具和概念来评估本世纪的候选产品。结果，进入临床试验的绝大多数研究产品都失败了。”(usfda；2004“innovation orstagnation: challenge and opportunity on the critical path to new medicalproducts," at https://www.who.int intellectualproperty/documents/en/fdaproposals.pdf)。该声明对于有效局部用产品的开发尤其是那些目标作用部位位于皮肤下(例如软组织或关节)的产品特别重要。临床候选药物的选择在很大程度上取决于使用franz扩散池(fdc)评估其跨皮肤屏障输送活性药物成分(api)的能力。尽管它历史悠久(franz, t. j., 1975, j. invest.dermatol. 64 (3), 190-195)，但它仍然是局部用药物开发过程中应用最广泛的主力药物。尽管如此，fdc也有局限性，虽然这种方法可以提供与api跨皮肤屏障(角质层或sc)的被动扩散相关的可靠数据，但它几乎无法揭示下游(例如深层真皮)中赋形剂依赖性api的生物分布，因为api不易从皮肤下层释放，因此在受体液中无法检测到。基于生理的药代动力学建模和模拟(pbpk)是一种计算机建模方法，它结合了器官的血流和组织组成来确定药物的药代动力学(pk)。fda倾向于使用pbpk，因为这种方法可以减少或免除昂贵且冗长的临床试验。然而，与fdc一样，这些方法也有局限性。例如，目前的局部吸收模型包括生物过程，这些过程仅通过使用血浆药代动力学推断进行验证，并且仅在极少数情况下通过组织采样进行验证。使用模型生成的局部和全身api生物利用度预测来比较具有不同组成和/或物理和结构特性的复杂药物制剂仍然是一项艰巨的任务。在存在不同非活性成分的情况下，基于定量结构活性关系(qsar)估计api透皮扩散的扩散系数(d)和溶质分配系数(k)仍然不够精确，而且考虑到许多赋形剂组合产生的协同效应，通常甚至不可行。因此需要改进方法来表征用于局部给药至皮肤不同层的产品的api递送。
背景技术：
技术实现思路
1、本发明人发现，开放式微灌注(ofm)可与扩散池装置(尤其是franz扩散池(fdc))组合使用，以提供改进的体外方法来评估化合物(例如api)向皮肤的扩散。通过首次组合这两种方法(fdc和ofm)，获得了新的、方便的方法来评估赋形剂对api跨sc屏障被动扩散的影响–这是仅单独使用fdc或ofm无法轻易实现的可能性。
2、因此，在第一方面，提供了一种评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括：
3、(i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的表面上，使用扩散池(dc)确定第一皮肤外植体中的化合物的浓度；和
4、(ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的表面上，使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体中的化合物的浓度。
5、该化合物可以是活性药物成分(api)。具体而言，该化合物是包含该化合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物的一部分。更具体地说，该化合物是配制用于局部应用的组合物的一部分。在一些实施方案中，该化合物是双氯芬酸或其盐。具体而言，该化合物是双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。
6、根据本发明的另一个方面，用于确定包含活性成分和至少一种药学上可接受的载体的局部用药物组合物的皮肤渗透特征的体外方法包括以下步骤：
7、(i)获取第一皮肤外植体的真皮上层内的活性成分的时间分辨浓度数据，其中使用扩散池获取该浓度数据；
8、(ii)获取第二皮肤外植体的真皮下层和/或皮下组织中的活性成分的时间分辨浓度数据，其中使用开放式微灌注获取该浓度数据；
9、(iii)生成活性成分在真皮上层、真皮下层和/或皮下组织中浓度数据随时间变化的时间分辨曲线。
10、优选地，开放式微灌注使用包含1%人血清白蛋白的灌注液。
11、优选地，扩散池装置是franz扩散池(fdc)。
12、第一和第二皮肤外植体可以是同一皮肤外植体的不同部分或两个不同的皮肤外植体。本发明方法中用于dc特别是fdc的皮肤外植体包括具有外角质层和真皮上层的表皮层。本发明方法中用于ofm的皮肤外植体包括具有外角质层、真皮上层、真皮下层和皮下层的表皮层。
13、步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次(即先进行(i)然后进行(ii)或先进行(ii)然后进行(i))或并行(即同时)进行。
14、优选地，施用该化合物的皮肤外植体的表面是角质层。因此，该方法可以包括将该化合物施用到第一皮肤外植体的角质层和/或将该化合物施用到第二皮肤外植体的角质层。
15、具体而言，皮肤外植体中化合物的浓度是在远离角质层的皮肤外植体内(例如在表皮层、真皮上层、真皮下层和/或皮下层内)的部位测定的。
16、在某些实施方案中，该方法包括使用扩散池(dc)确定第一皮肤外植体的真皮上层中的化合物浓度。在某些实施方案中，该方法包括使用franz扩散池(fdc)确定第一皮肤外植体的真皮上层中的化合物浓度。术语“真皮上层”在本文中用于表示真皮的上部，例如在距角质层表面0.2mm至0.4mm的范围内。
17、该方法可以包括使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体的真皮层(优选真皮下层)内的化合物浓度。术语“真皮下层”在本文中用于表示真皮的下部，距离角质层上表面0.5mm至1.5mm之间，优选0.8mm至1.2mm之间，优选约1mm。该方法可以包括使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体的皮下层内的化合物浓度。皮下层内的测量可以例如在距离角质层上表面2.5mm至3.5mm之间进行。
18、在优选实施方案中，该方法包括使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体的真皮下层和皮下层内的化合物浓度。
19、具体地，对皮肤外植体中的化合物的浓度进行多次例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次测定。
20、具体而言，在多个不同的时间点多于一次测定皮肤外植体中化合物的浓度。例如，可以每小时测定一次浓度，或每2小时测定一次浓度，总时间段至少为12小时，或优选至少为24小时。
21、在一些实施方案中，提供了评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括：
22、(i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的表面上，使用扩散池(dc)确定第一皮肤外植体中的化合物在多个不同时间点的浓度；和
23、(ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的表面上，使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体中的化合物在多个不同时间点的浓度。
24、更具体地说，在从化合物首次施加到皮肤外植体表面的时间开始的一段时间内(例如在24小时内)的不同时间点重复确定皮肤外植体中化合物浓度的步骤。在一些实施方案中，在24小时内每小时重复确定化合物浓度的步骤。优选地，在一系列时间间隔内获得一系列测量值，并用于生成化合物浓度的时间分辨曲线。该时间分辨曲线显示了化合物在皮肤外植体中的多个位置的浓度随时间的变化。具体而言，ofm和fdc生成的数据相组合，提供在皮肤外植体的表皮层、真皮层和皮下层中化合物的浓度随时间变化的时间分辨曲线。
25、如上所述，fdc不是测量真皮下层或皮下组织中化合物浓度的合适方法。同时，ofm探针通常使用套管作为引导，手动插入皮肤外植体中，并且很难插入表皮或真皮上层。因此，这两种方法的组合是独一无二的，因为它可以获得跨多层皮肤的渗透曲线，而这两种方法都无法单独提供。
26、因此，在本发明的第二方面，提供了评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括：
27、(i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的角质层，使用扩散池(dc)确定第一皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；和
28、(ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体的真皮下层和皮下层中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度。
29、(iii)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下层中化合物的浓度随时间变化的时间分辨曲线。
30、步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次或并行进行。
31、在一些实施方案中，该化合物是双氯芬酸或其盐。具体而言，该化合物是双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。
32、在本发明的第三方面，提供了用于比较赋形剂对化合物扩散到皮肤的影响的体外方法，包括：
33、(i)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(dc)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；
34、(ii)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(ofm)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；
35、(iii)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(dc)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；
36、(iv)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(ofm)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；
37、(v)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物的浓度随时间变化的第一时间分辨曲线；
38、(vi)组合(iii)和(iv)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物的浓度随时间变化的第二时间分辨曲线；和
39、(vii)比较第一和第二时间分辨曲线；
40、其中步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)以任何顺序(依次或并行)进行，步骤(v)在步骤(i)和(ii)均完成后进行，步骤(vi)在步骤(iii)和(iv)均完成后进行，并且其中步骤(vii)在步骤(v)和(vi)完成后进行。
41、在一些实施方案中，第一和第二制剂包含不同的赋形剂。在一些实施方案中，第一和第二制剂包含不同量或浓度的相同赋形剂。
42、在某些实施方案中，该方法是用于确定生物等效性的体外方法，其中该化合物是api，并且其中第一或第二制剂之一是包含api的局部用制剂，而第一或第二制剂中的另一个是包含api的测试制剂。
43、在本发明的第四方面，提供了确定包含化合物的第一制剂和包含该化合物的第二制剂的生物等效性的方法，该方法包括：
44、(i)生成用于第一制剂的皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度数据随时间变化的时间分辨曲线，其中浓度数据是使用franz扩散池和开放式微灌注从体外采集的样本中获得的；
45、(ii)生成用于第二制剂的皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度数据随时间变化的时间分辨曲线，其中浓度数据是使用franz扩散池和开放式微灌注从体外采集的样本中获得的；和
46、(iii)比较第一和第二时间分辨曲线来确定生物等效性。
47、具体地，第一制剂包含化合物(例如api)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。具体地，第二制剂包含化合物(例如api)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。具体地，第一和第二制剂包含相同的化合物，例如相同的api。具体地，使用第一、第二或第三方面的体外方法生成浓度数据。
1.评估化合物向皮肤扩散的体外方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1的体外方法，其中所述开放式微灌注利用包含1％人血清白蛋白的灌注液。
3.根据权利要求1或2的体外方法，其中所述扩散池装置是franz扩散池(fdc)，特别是静态franz扩散池。
4.根据权利要求1、2或3的体外方法，其中所述第一皮肤外植体包括具有外角质层和真皮上层的表皮层，并且其中所述表面是角质层。
5.根据权利要求1、2、3或4的体外方法，其中所述第二皮肤外植体包括具有外角质层、真皮上层、真皮下层和皮下层的表皮层，其中所述表面是角质层。
6.根据权利要求5的体外方法，其中步骤(i)包括使用静态franz扩散池确定第一皮肤外植体的真皮上层内的化合物浓度。
7.根据权利要求6的体外方法，其中步骤(ii)包括使用开放式微灌注(ofm)确定第二皮肤外植体的真皮下层和/或皮下层内的化合物浓度。
8.根据权利要求7的体外方法，其中确定第一和第二皮肤外植体中化合物浓度的步骤在至少12小时、优选至少24小时的时间段内重复多次。
9.根据前述权利要求中任一项的体外方法，其还包括生成化合物浓度的时间分辨曲线的步骤。
10.根据前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述化合物是包含至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的局部用组合物的一部分，所述局部用组合物被施用于第一和第二皮肤外植体的表面。
11.根据前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二皮肤外植体是人类皮肤外植体。
12.用于比较赋形剂对化合物扩散到皮肤的影响的体外方法，其包括：
13.根据权利要求12的体外方法，其用于确定生物等效性，其中所述化合物是活性药物成分(api)，并且其中第一或第二制剂之一是包含api的局部用制剂，而第一或第二制剂中的另一个是包含api的测试制剂。
14.用于确定包含活性成分和至少一种药学上可接受的载体的局部用药物组合物的皮肤渗透特征的体外方法，所述方法包括：
15.根据权利要求1至14中任一项的体外方法，其中所述活性药物成分是双氯芬酸或其盐，特别是双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。
