本发明属于海水鱼神经坏死病毒检测，具体涉及一种海水鱼神经坏死病毒的可视化rt-lamp检测。
背景技术：
1、由于大多数逆转录酶缺乏3′- 5′核酸外切酶校对结构域，导致其在dna合成中具有低保真度。为解决相关问题，安德鲁·艾灵顿的通过体外进化策略，从古细菌b家族dna聚合酶进行逆转录酶定向进化，开发出一种具有校对活性的高保真、耐热的dna聚合酶，并命名为逆转录酶（rtx）。bst dna聚合酶具有3'-5'外切酶活性，同时，bst dna聚合酶还具有高度的活性和扩增效率，可在短时间内扩增出大量目标dna序列。因此，在一些特殊的扩增反应中，如低质量dna模板扩增和复杂结构片段扩增等方面具有明显的优势。另外，bst dna聚合酶拥有强热稳定性和链置换活性的先天能力，它可在60℃-65℃进行反应，从而促进了等温扩增发展。rna病毒检测大多依赖两步法，即先将rna逆转录为cdna后，再以cdna为模板扩增检测，该策略繁琐复杂，耗时耗力。而rtx反转录酶和bst dna聚合酶的联合使用可多rna靶标进行一步扩增，可简化操作流程，提高样品检测效率。
2、可视化rt-lamp扩增依赖金属离子敏感的钙黄绿素显色指示剂对扩增结果进行肉眼判读，其原理为在起始阶段与mn2+结合，呈猝灭状态，随着lamp反应的进行，mn2+被反应底物dntps产生p2o74-剥离下来，产生荧光，此外反应混合物中的游离的mg2+与钙黄绿素结合，增强荧光，阳性和阴性实验的颜色变化对比强烈。本发明相比于需要精密控温设备的pcr和qpcr技术，只需要一个简单的恒温加热器。如水浴锅，金属浴，即可直接检测rna病毒。不仅降低交叉污染的概率，缩短检测时间，而且结果可通过肉眼进行判断，更加有利于基层检测。
技术实现思路
1、发明目的：本发明所要解决的技术问题在于提供一种海水鱼神经坏死病毒可视化检测的rt-lamp体系。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种海水鱼神经坏死病毒可视化rt-lamp检测方法，包括步骤：
3、1）提取样本rna；
4、2）设计并合成rt-lamp引物，所述rt-lamp引物包括外引物f3、b3，内引物fip、bip，环状引物lf、lb。引物组核苷酸序列如下所示：
5、f3：agtcgttgccaaatggtgg；
6、b3：gcggtagtctcttcaggtgt；
7、fip：gacgctgctcctttcccacgaacagtccgaccccagt；
8、bip：ggagtgttcgattgagcgtttgccgacacacaggagt；
9、lf：cagaggagcgtgcgggtg；
10、lb：gatgtggtcaacgtgtcag；
11、 3）检测可行性验证；
12、4）优化钙黄绿素和mncl2浓度比；
13、5）检测特异性验证；
14、6）检测灵敏度验证；
15、步骤1）中，根据eastep super 总rna提取试剂盒的操作步骤提取石斑鱼神经坏死病毒rna；
16、步骤3）中，使用分子生物级别的无核酶水作为待测样本空白对照。
17、步骤3）中，所述可视化rt-lamp反应体系如下：
18、 成分 浓度 体积 （µl） bst 40 ng/µl 1.0 rtx 40 ng/µl 1.0 rna- sample 1.0 dntps mix(10mm) 各1.4mm 3.5 mgso4 (100 mm) 6mm （一共8 mm） 1.5 10×isothermal amplification buffer 1× （包含2mm mgso4） 2.5 fip/bip primers（50µm） 1.6µm 0.8 f3/r3 primers（10µm） 0.2µm 0.5 loopf/b primers（10µm） 0.4µm 1.0 5 m甜菜碱 1.2 mm 4.0 钙黄绿素 0.1 mm 1.0 <![cdata[mncl<sub>2</sub>]]> 1.2 mm 0.9 nuclease-free h2o 4.0 总体积 25.0
19、步骤3）中，所述可视化rt-lamp扩增条件为：60℃，45 min，反应结束后，溶液颜色显示为绿色为阳性，保持橙色为阴性。
20、步骤3）中，用可视化rt-lamp扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：取5 μl产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，有阶梯状条带的判断为阳性，无条带的为阴性。
21、步骤4）中，钙黄绿素和氯化锰浓度比依次为1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14。
22、步骤5）中，特异性验证的对照样品为：石斑鱼虹彩病毒、大肠杆菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌。
23、步骤6）中，将106 fm-1 fm神经坏死病毒rna进行可视化rt-lamp扩增，验证该检测体系灵敏度。
24、本发明用于可视化检测神经坏死病毒的rt-lamp技术，在检测体系中加入rtx逆转录酶和bst dna聚合酶，和显色指示剂钙黄绿素即可，不需要将rna逆转为cdna后再进行扩增，集rna扩增和结果判定于一管，大大降低了操作难度，提高了检测效率。同时，该技术不依赖精密的控温设备，仅需一个恒温加热仪器，如金属浴，水浴锅，即可完成检测，经济节约，适用于基层快速检测。
1.一种海水鱼神经坏死病毒可视化rt-lamp检测体系，其特征在于，以下步骤：
2.如权利要求1所述的海水鱼神经坏死病毒可视化rt-lamp检测体系的方法，根据eastep super 总rna提取试剂盒的操作步骤提取石斑鱼神经坏死病毒rna，得到待检测rna。
3.如权利要求1所述步骤，所述4）中，体系中所用酶为rtx反转录酶，包括但不限于同时具有依赖rna和dna模板的dna聚合酶活性的非重组酶。
4.如权利要求1所述步骤，所述4）中，可视化rt-lamp扩增体系为2.5 μl0×isothermalamplification buffer、1.5 μl mgso4 (6 mm)、3.5 μl dntps mix (各1.5 mm)、0.8 μlfip (1.6 µm)、0.8 μl bip (1.6 µm)、0.5 μl f3 (0.2 µm)、0.5 μl b3 (0.2 µm)、1.0 μllf (0.4 µm)、1.0 μl lb (0.4 µm)、4.0 μl甜菜碱(1.2 mm)、1.0 μl钙黄绿素(0.1 mm)、1.0 μl mncl2 (1.0 mm)、1.0 μl bst dna聚合酶、1.0 μl rtx 反转录酶、1.0 μl 神经坏死病毒rna、3.9 μl nuclease-free h2o。 得到的待检测rna建立rt-lamp反应体系，将所述lamp反应体系在温度为60℃的条件下等温反应45min进行扩增。
5.如权利要求1所述步骤，所述4）中，可视化rt-lamp扩增条件为：60℃，45 min，反应结束后，颜色显示为绿色为阳性，颜色保持橙色为阴性。
6.如权利要求1所述步骤，所述4）中，可视化rt-lamp产物琼脂糖凝胶电泳验证：取5 μl扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，有阶梯状条带的判断为阳性，无条带的为阴性。
7.如权利要求1所述步骤，所述5）中，钙黄绿素和氯化锰浓度比依次为1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14。
8.如权利要求1所述步骤，所述6）中，使用石斑鱼虹彩病毒、大肠杆菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌的核酸作为特异性检测的对照样本。
9.如权利要求1所述步骤，所述7）中，对神经坏死病毒rna进行梯度稀释至1 fm，并进行可视化rt-lamp扩增，验证该检测体系灵敏度。
