本发明涉及一种检测方法，尤其是一种多重核酸检测方法；本发明还涉及该方法相关的产品，比如组合物、产品组合、试剂、试剂盒、系统。
背景技术：
1、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最初是从细菌的天然免疫系统中发现的，其通过靶向特定的基因序列，可以精确地进行基因组的编辑和修饰，广泛应用于基因编辑领域。随着科研人员对crispr技术研究的不断深入，发现了v型和vi型cas蛋白存在反式切割活性(trans-cleavage activity)，可以应用于核酸检测领域，并开发了相应的crispr核酸检测系统，其中最具代表性的是张锋博士团队开发的sherlock、王金博士团队开发的holmes。crispr核酸检测系统具有高度的特异性和敏感性，可用于检测病毒、细菌、基因突变等多种生物学标志物。该系统在医学诊断、动物传染病检测和食品安全等领域具有广泛的应用前景，因其检测快速、设备要求低、检测方式灵活多样等特点而备受关注。
2、crispr核酸检测系统最早采用crispr两步法检测体系，该检测过程中首先需要将核酸模板进行扩增反应，然后将扩增产物加入到crispr核酸检测系统中进行检测。crispr两步法检测充分利用了cas蛋白的反式切割活性，具有高灵敏度和高特异性，但存在操作过程稍繁琐，扩增产物开盖加样检测容易引起气溶胶污染等问题。后续为了改进crispr两步法检测存在的不足之处，王金博士团队率先开发了基于等温扩增的一步法检测体系holmesv2，该crispr核酸检测一步法检测体系将等温扩增(如lamp)和crispr核酸检测在一管反应体系中一步完成，简化了操作流程，并避免了crispr两步法检测过程中扩增产物开盖容易引起气溶胶污染的风险。
3、利用crispr核酸检测系统实现多重核酸检测，是crispr核酸检测重要的发展方向。为此科研人员提出了多种方案，但特异性较差。
技术实现思路
1、本发明的第一方面目的是提出crispr一管双重一步法检测体系的建立方法。
2、在一优选例中，本发明提供了crispr一管双重一步法检测体系的建立方法，包括以下步骤：
3、一种crispr一管双重一步法检测体系的建立方法，包括以下步骤：
4、1)、针对第一核酸靶标，设计并筛选出第一扩增引物，筛选出的第一扩增引物针对所述第一核酸靶标的扩增效率最佳；
5、针对第二核酸靶标，设计并初步筛选出第二扩增引物，初步筛选出的第二扩增引物针对所述第二核酸靶标能有效扩增；
6、针对所述筛选出的第一扩增引物扩增所得的扩增产物序列，设计向导rna，将所述向导rna对应的crispr核酸检测体系与所述筛选出的第一扩增引物对应的扩增体系结合构建crispr一步法检测体系；
7、2)、将步骤1)所述的初步筛选出的第二扩增引物加入到步骤1)获得的所述crispr一步法检测体系中，筛选出对所述crispr一步法体系性能影响最小的第二扩增引物，针对对所述crispr一步法体系性能影响最小的第二扩增引物扩增所得的扩增产物序列，设计检测所述第二核酸靶标的探针，完成探针法体系的建立；
8、3)、将所述crispr一步法检测体系和所述探针法体系组合，从而构建crispr一管双重一步法检测体系；
9、优选地，所述步骤2)中，以对crispr一步法体系出峰时间的影响作为筛选出对所述crispr一步法体系性能影响最小的第二扩增引物的依据，更优选地，分别测定所述第二扩增引物加入crispr一步法体系前后的所述crispr一步法体系的出峰时间tt值，两者的差值δtt＜10min，优选＜5min，更优选＜3min作为筛选出对所述crispr一步法体系性能影响最小的第二扩增引物的依据。
10、在一优选实施方式中，第一扩增引物为扩增待检核酸分子的引物，待检核酸分子优选包括结核分枝杆菌复合群is6110插入序列、新型冠状病毒n基因、布鲁氏菌bscp31基因。
11、在一优选实施方式中，第二扩增引物为扩增内参基因的引物，内参基因优选包括人ribonuclease p基因、人β-globulin基因、枯草芽孢杆菌16s rrna基因。
12、如本文所述，“扩增效率最佳”的要求如下：在体系中进行引物扩增效率筛选时，具有扩增信号出峰时间最早，且不出现非特异性扩增信号或非特异性扩增信号出峰时间最晚的引物，则该引物扩增效率最佳。
13、本发明的第二方面目的是提出一种多重核酸检测方法，以解决目前基于核酸扩增检测和crispr核酸扩增检测进行多重核酸检测存在的特异性较差的技术问题。
14、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。
15、一种多重核酸检测方法，包括以下步骤：在同一容器内，扩增第一核酸靶标和检测第一核酸靶标，并同时在所述同一容器内，扩增第二核酸靶标和检测第二核酸靶标；
16、所述检测第一核酸靶标的采用crispr核酸检测方法或ago蛋白核酸检测方法，所述检测第二核酸靶标采用探针法。
17、本发明的多重核酸检测方法，在同一容器内进行，可以称为一管多重核酸检测方法。当检测的靶标只是双重时，可以称为一管双重核酸检测方法。
18、优选地，所述扩增第一核酸靶标和所述检测第一核酸靶标同时进行，所述扩增第二核酸靶标和所述检测第二核酸靶标同时进行。在这个技术方案中，一步实现了多重靶标的扩增与检测，这样的技术方案可以称为一管一步法多重核酸检测方法；当检测的靶标只是双重时，可以称为一管一步法双重核酸检测方法。
19、在上述任一技术方案基础上优选地，所述探针法是分子信标法或rnase hii探针法；更优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针经过修饰，又更优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针经过硫代修饰。将分子信标法或rnase hii探针修饰(如硫代修饰)，是为了避免crispr核酸检测时被切割，尤其是被反式切割。
20、在上述任一技术方案基础上优选地，所述扩增第一核酸靶标和所述扩增第二核酸靶标采用相同的核酸扩增方法。更优选地，所述扩增第一核酸靶标和所述扩增第二核酸靶标采用相同的恒温核酸扩增方法；又更优选地，所述恒温核酸扩增方法选自下组的一种：lamp(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)、rpa(recombinasepolymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)、raa(recombinase aidedamplification，重组酶介导的等温核酸扩增技术)、era(enzymatic recombinaseamplification，酶促重组等温扩增技术)、mira(multienzyme isothermal rapidamplification，多酶恒温快速扩增技术)、bdna(branched dna amplification，分支dna扩增)、nasba(nuclear acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增)、sda(strand displacement amplification,链置换扩增)、tma(transcription-mediatedamplification，转录介导的扩增)、rca(rolling circle amplification，滚环扩增)、hda(helicase-dependent amplification，解旋酶依赖性扩增)、spia(single primerisothermal amplification，单引物等温扩增)、near(nicking enzyme amplificationreaction，切口酶扩增反应)、smap(smart amplification process，智能扩增方法)、smap2(smart amplification process version 2，第2版智能扩增方法)、cpa(cross primingamplification，交叉引物扩增)、mda(multiple displacement amplification，多重置换扩增)、ram(ramification)、chda(circular helicase-dependent amplification,依赖解旋酶的环形扩增)、smart(signal mediated amplification of rna technology，rna的信号介导扩增技术)、3sr(self-sustained sequence replication，自主序列复制系统)、gear(genome exponential amplification reaction，基因组指数扩增反应)、imda(isothermal multiple displacement amplification，等温多重置换扩增)、tas(transcription-based amplification system,转录依赖的扩增系统)、rida(rapidisothermal detection and amplification快速等温检测放大技术)、nema(nickingenzyme mediated isothermal amplification，切刻内切酶核酸恒温扩增)、expar(exponential isothermal amplification reaction，指数等温扩增)、ican(isothermaland chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids,嵌合引物引发的核酸等温扩增)、sea(strand exchange amplification,链交换扩增)、sharp(ssb-helicaseassisted rapid pcr，ssb-解旋酶介导的快速pcr)、等温多自配引发扩增(isothermalmultiple self-matching-initiated amplification,imsa)、全基因组扩增(wholegenome amplification,wga)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,psr)或其组合。
21、在上述任一技术方案基础上优选地，所述crispr核酸检测方法采用选自下组的一种或多种cas蛋白：i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白；
22、或者，所述crispr核酸检测方法采用选自下组的一种或多种所述cas蛋白：cas3，cas9，cas10，cas12和cas13。
23、目前检测用cas蛋白，主要是i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白，或者说是cas3，cas9，cas10，cas12和cas13。cas14目前已经归类为cas12f，属于cas12。
24、更优选地，v型cas蛋白是v-b型cas蛋白；或者，所述cas12是cas12b。
25、又更优选地，所述crispr核酸检测方法采用的cas蛋白是v-b型cas蛋白或cas12b，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针是rna探针。v-b型cas蛋白或cas12b反式切割单链dna，rna探针可以避免被v-b型cas蛋白或cas12b反式切割。
26、在上述任一技术方案基础上优选地，所述crispr核酸检测方法是利用顺式切割活性进行的crispr核酸检测方法或者利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法；更优选地，所述crispr核酸检测方法是利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法，所述利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法采用荧光标记的报告分子报告荧光信号，且所述荧光信号与所述探针法的荧光信号不同；又更优选地，所述荧光标记的报告分子是荧光标记的单链核酸、单链核酸类似物或单链核酸和核酸类似物，且不与体系中的向导rna的导向序列杂交。
27、在上述任一技术方案基础上优选地，所述第二核酸靶标是内参基因；或者，所述第一核酸靶标是内参基因。在所述第二核酸靶标是内参基因的技术方案中，因为采用所述探针法检测所述内参基因，采用所述crispr核酸检测方法检测所述待检核酸分子，所以特异性更好。
28、在上述任一技术方案基础上优选地，所述分子信标包括寡聚核苷酸及两端标记的荧光基团和淬灭基团，所述寡聚核苷酸两端为互补序列，所述寡聚核苷酸在非使用状态时通过两端的所述互补序列形成茎干区和环状区而保持发夹环构象，所述环状区是与所述第二核酸靶标序列互补的单链核酸；优选地，所述茎干区长度为5-10nt，所述环状区长度为15-35nt；优选地，所述分子信标的寡聚核苷酸为rna，或者所述分子信标的所述环状区为rna、所述茎干区为dna，或者所述环状区使用硫代修饰；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texas red、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar 670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合；
29、或者，
30、所述rnase hii探针是能与所述第二核酸靶标杂交的序列，包含至少1个rna碱基，两端分别标记荧光基团和淬灭基团；优选地，在所述rna碱基左侧靠近所述rnase hii探针5’端一侧的碱基上标记淬灭基团，在所述rna碱基靠近所述rnase hii探针3’端一侧的碱基上标记荧光基团；优选地，所述rnase hⅱ荧光探针长度为15-45bp，所述rnase hⅱ探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-20bp；优选地，荧光基团和淬灭基团之间的dna序列使用硫代修饰；优选地，所述rna碱基的右侧所述探针片段的长度为2-10bp；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texasred、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合。
31、在上述任一技术方案基础上优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针的终浓度为50-1000nm，优选100-800nm，更优选150-500nm。
32、本发明的第三方面目的是提出一种多重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，以解决目前基于核酸扩增检测和crispr核酸扩增检测进行多重核酸检测存在的特异性较差的技术问题。
33、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。
34、一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，包括以下组成部分：能在同一容器内，扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和检测第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，并能同时在所述同一容器内，扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和检测第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统；
35、所述检测第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统或ago蛋白核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，优选地，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统包括：
36、cas蛋白，和
37、向导rna，所述向导rna包括能够结合cas蛋白的同向重复(direct repeat，dr)序列和能够靶向所述第一核酸靶标的导向序列；
38、所述检测第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用探针法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统。
39、本发明的多重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，能在同一容器内进行，可以称为一管多重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统。当检测的靶标只是双重时，可以称为一管双重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统。
40、优选地，所述扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和所述检测第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是能同时进行的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，所述扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和所述检测第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是能同时进行的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统。在这个技术方案中，能一步实现多重靶标的扩增与检测，这样的技术方案可以称为一管一步法多重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统；当检测的靶标只是双重时，可以称为一管一步法双重核酸检测组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统。
41、在上述任一技术方案基础上优选地，所述探针法是分子信标法或rnase hii探针法；更优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针经过修饰，又更优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针经过硫代修饰。将分子信标法或rnase hii探针修饰(如硫代修饰)，是为了避免crispr核酸检测时被切割，尤其是被反式切割。
42、在上述任一技术方案基础上优选地，所述扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和所述扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用相同的聚合酶；更优选地，所述扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和所述扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用相同的恒温核酸扩增方法的聚合酶；优选地，所述恒温核酸扩增方法选自下组的一种：lamp(loop-mediatedisothermal amplification，环介导等温扩增)、rpa(recombinase polymeraseamplification，重组酶聚合酶扩增)、raa(recombinase aided amplification，重组酶介导的等温核酸扩增技术)、era(enzymatic recombinase amplification，酶促重组等温扩增技术)、mira(multienzyme isothermal rapid amplification，多酶恒温快速扩增技术)、bdna(branched dna amplification，分支dna扩增)、nasba(nuclear acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增)、sda(strand displacementamplification,链置换扩增)、tma(transcription-mediated amplification，转录介导的扩增)、rca(rolling circle amplification，滚环扩增)、hda(helicase-dependentamplification，解旋酶依赖性扩增)、spia(single primer isothermal amplification，单引物等温扩增)、near(nicking enzyme amplification reaction，切口酶扩增反应)、smap(smart amplification process，智能扩增方法)、smap2(smart amplificationprocess version 2，第2版智能扩增方法)、cpa(cross priming amplification，交叉引物扩增)、mda(multiple displacement amplification，多重置换扩增)、ram(ramification)、chda(circular helicase-dependent amplification,依赖解旋酶的环形扩增)、smart(signal mediated amplification of rna technology，rna的信号介导扩增技术)、3sr(self-sustained sequence replication，自主序列复制系统)、gear(genomeexponential amplification reaction，基因组指数扩增反应)、imda(isothermalmultiple displacement amplification，等温多重置换扩增)、tas(transcription-basedamplification system,转录依赖的扩增系统)、rida(rapid isothermal detection andamplification快速等温检测放大技术)、nema(nicking enzyme mediated isothermalamplification，切刻内切酶核酸恒温扩增)、expar(exponential isothermalamplification reaction，指数等温扩增)、ican(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids,嵌合引物引发的核酸等温扩增)、sea(strand exchange amplification,链交换扩增)、sharp(ssb-helicase assisted rapidpcr，ssb-解旋酶介导的快速pcr)、等温多自配引发扩增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,imsa)、全基因组扩增(whole genomeamplification,wga)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,psr)或其组合。
43、在上述任一技术方案基础上优选地，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用选自下组的一种或多种cas蛋白：i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白；
44、或者，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用选自下组的一种或多种cas蛋白：cas3，cas9，cas10，cas12和cas13。
45、目前检测用cas蛋白，主要是i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白，或者说是cas3，cas9，cas10，cas12和cas13。cas14目前已经归类为cas12f，属于cas12。
46、更优选地，v型cas蛋白是v-b型cas蛋白；
47、或者，所述cas12是cas12b。
48、又更优选地，所述crispr核酸检测方法采用的cas蛋白是v-b型cas蛋白或cas12b，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针是rna探针。v-b型cas蛋白或cas12b反式切割单链dna，rna探针可以避免被v-b型cas蛋白或cas12b反式切割。
49、在上述任一技术方案基础上优选地，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是利用顺式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统或者利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统；更优选地，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，所述利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统包括荧光标记的报告分子，且所述荧光标记的报告分子的荧光信号，与所述探针法所用探针的荧光信号不同；又更优选地，所述荧光标记的报告分子是荧光标记的单链核酸、单链核酸类似物或单链核酸和核酸类似物，且不与体系中的向导rna的导向序列杂交。
50、在上述任一技术方案基础上优选地，所述第二核酸靶标是内参基因；或者，所述第一核酸靶标是内参基因。在所述第二核酸靶标是内参基因的技术方案中，采用所述探针法检测所述内参基因，因为采用所述crispr核酸检测方法检测所述待检核酸分子，所述特异性更好。
51、在上述任一技术方案基础上优选地，所述分子信标包括寡聚核苷酸及两端标记的荧光基团和淬灭基团，所述寡聚核苷酸两端为互补序列，所述寡聚核苷酸在非使用状态时通过两端的所述互补序列形成茎干区和环状区而保持发夹环构象，所述环状区是与所述第二核酸靶标序列互补的单链核酸；优选地，所述茎干区长度为5-10nt，所述环状区长度为15-35nt；优选地，所述分子信标的寡聚核苷酸为rna，或者所述分子信标的所述环状区为rna、所述茎干区为dna，或者所述环状区使用硫代修饰；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texas red、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar 670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合；
52、或者，
53、所述rnase hii探针是能与所述第二核酸靶标杂交的序列，包含至少1个rna碱基，两端分别标记荧光基团和淬灭基团；优选地，在所述rna碱基左侧靠近所述rnase hii探针5’端一侧的碱基上标记淬灭基团，在所述rna碱基靠近所述rnase hii探针3’端一侧的碱基上标记荧光基团；优选地，所述rnase hⅱ荧光探针长度为15-45bp，所述rnase hⅱ探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-20bp；优选地，荧光基团和淬灭基团之间的dna序列使用硫代修饰；优选地，所述rna碱基的右侧所述探针片段的长度为2-10bp；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texasred、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合。
54、在上述任一技术方案基础上优选地，所述分子信标法或rnase hii探针所用的探针的终浓度为50-1000nm，优选100-800nm，更优选150-500nm。
55、本发明的多重核酸检测方法及其组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，采用采用探针法检测和crispr核酸检测实现多重检测，特异性好，特别是一管一步法多重检测的方案，特异性好，杜绝了气溶胶污染，假阳性低。
1.一种多重核酸检测方法，包括以下步骤：在同一容器内，扩增第一核酸靶标和检测第一核酸靶标，并同时在所述同一容器内，扩增第二核酸靶标和检测第二核酸靶标；
2.如权利要求1所述的一种多重核酸检测方法，其特征在于，所述扩增第一核酸靶标和所述扩增第二核酸靶标采用相同的恒温核酸扩增方法；优选地，所述恒温核酸扩增方法选自下组的一种：lamp(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)、rpa(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)、raa(recombinase aidedamplification，重组酶介导的等温核酸扩增技术)、era(enzymatic recombinaseamplification，酶促重组等温扩增技术)、mira(multienzyme isothermal rapidamplification，多酶恒温快速扩增技术)、bdna(branched dna amplification，分支dna扩增)、nasba(nuclear acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增)、sda(strand displacement amplification,链置换扩增)、tma(transcription-mediatedamplification，转录介导的扩增)、rca(rolling circle amplification，滚环扩增)、hda(helicase-dependent amplification，解旋酶依赖性扩增)、spia(single primerisothermal amplification，单引物等温扩增)、near(nicking enzyme amplificationreaction，切口酶扩增反应)、smap(smart amplification process，智能扩增方法)、smap2(smart amplification process version 2，第2版智能扩增方法)、cpa(cross primingamplification，交叉引物扩增)、mda(multiple displacement amplification，多重置换扩增)、ram(ramification)、chda(circular helicase-dependent amplification,依赖解旋酶的环形扩增)、smart(signal mediated amplification of rna technology，rna的信号介导扩增技术)、3sr(self-sustained sequence replication，自主序列复制系统)、gear(genome exponential amplification reaction，基因组指数扩增反应)、imda(isothermal multiple displacement amplification，等温多重置换扩增)、tas(transcription-based amplification system,转录依赖的扩增系统)、rida(rapidisothermal detection and amplification快速等温检测放大技术)、nema(nickingenzyme mediatedisothermal amplification，切刻内切酶核酸恒温扩增)、expar(exponential isothermal amplification reaction，指数等温扩增)、ican(isothermaland chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids,嵌合引物引发的核酸等温扩增)、sea(strand exchange amplification,链交换扩增)、sharp(ssb-helicaseassisted rapid pcr，ssb-解旋酶介导的快速pcr)、等温多自配引发扩增(isothermalmultiple self-matching-initiated amplification,imsa)、全基因组扩增(wholegenome amplification,wga)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,psr)或其组合。
3.如权利要求1-2中任一所述的一种多重核酸检测方法，其特征在于，所述crispr核酸检测方法采用选自下组的一种或多种cas蛋白：i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白；
4.如权利要求1-3任一项所述的一种多重核酸检测方法，其特征在于，所述crispr核酸检测方法是利用顺式切割活性进行的crispr核酸检测方法或者利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法；优选地，所述crispr核酸检测方法是利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法，所述利用反式切割活性进行的crispr核酸检测方法采用荧光标记的报告分子报告荧光信号，且所述荧光信号与所述探针法的荧光信号不同；更优选地，所述荧光标记的报告分子是荧光标记的单链核酸、单链核酸类似物或单链核酸和核酸类似物，且不与体系中的向导rna的导向序列杂交。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种多重核酸检测方法，其特征在于，所述分子信标包括寡聚核苷酸及两端标记的荧光基团和淬灭基团，所述寡聚核苷酸两端为互补序列，所述寡聚核苷酸在非使用状态时通过两端的所述互补序列形成茎干区和环状区而保持发夹环构象，所述环状区是与所述第二核酸靶标序列互补的单链核酸；优选地，所述茎干区长度为5-10nt，所述环状区长度为15-35nt；优选地，所述分子信标的寡聚核苷酸为rna，或者所述分子信标的所述环状区为rna、所述茎干区为dna，或者所述环状区使用硫代修饰；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texas red、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar 670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合；
6.一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，包括以下组成部分：能在同一容器内，扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和检测第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，并能同时在所述同一容器内，扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和检测第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统；
7.如权利要求6所述的一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，其特征在于，所述扩增第一核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统和所述扩增第二核酸靶标的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用相同的恒温核酸扩增方法的聚合酶；优选地，所述恒温核酸扩增方法选自下组的一种：lamp(loop-mediatedisothermal amplification，环介导等温扩增)、rpa(recombinase polymeraseamplification，重组酶聚合酶扩增)、raa(recombinase aided amplification，重组酶介导的等温核酸扩增技术)、era(enzymatic recombinase amplification，酶促重组等温扩增技术)、mira(multienzyme isothermal rapid amplification，多酶恒温快速扩增技术)、bdna(branched dna amplification，分支dna扩增)、nasba(nuclear acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增)、sda(strand displacementamplification,链置换扩增)、tma(transcription-mediated amplification，转录介导的扩增)、rca(rolling circle amplification，滚环扩增)、hda(helicase-dependentamplification，解旋酶依赖性扩增)、spia(single primer isothermal amplification，单引物等温扩增)、near(nicking enzyme amplification reaction，切口酶扩增反应)、smap(smart amplification process，智能扩增方法)、smap2(smart amplificationprocess version 2，第2版智能扩增方法)、cpa(cross priming amplification，交叉引物扩增)、mda(multiple displacement amplification，多重置换扩增)、ram(ramification)、chda(circular helicase-dependent amplification,依赖解旋酶的环形扩增)、smart(signal mediated amplification of rna technology，rna的信号介导扩增技术)、3sr(self-sustained sequence replication，自主序列复制系统)、gear(genomeexponential amplification reaction，基因组指数扩增反应)、imda(isothermalmultiple displacement amplification，等温多重置换扩增)、era(enzymaticrecombinase amplification，酶促重组等温扩增)、tas(transcription-basedamplification system,转录依赖的扩增系统)、rida(rapid isothermal detection andamplification快速等温检测放大技术)、nema(nicking enzyme mediatedisothermalamplification，切刻内切酶核酸恒温扩增)、expar(exponential isothermalamplification reaction，指数等温扩增)、ican(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids,嵌合引物引发的核酸等温扩增)、sea(strand exchange amplification,链交换扩增)、sharp(ssb-helicase assisted rapidpcr，ssb-解旋酶介导的快速pcr)、等温多自配引发扩增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,imsa)、全基因组扩增(whole genomeamplification,wga)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,psr)或其组合。
8.如权利要求6或7所述的一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，其特征在于，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统采用选自下组的一种或多种cas蛋白：i型cas蛋白，ii型cas蛋白，iii型cas蛋白，v型cas蛋白和vi型cas蛋白；
9.如权利要求6-8任一项所述的一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，其特征在于，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是利用顺式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统或者利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统；优选地，所述crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统是利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，所述利用反式切割活性进行的crispr核酸检测的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统包括荧光标记的报告分子，且所述荧光标记的报告分子的荧光信号，与所述探针法所用探针的荧光信号不同；更优选地，所述荧光标记的报告分子是荧光标记的单链核酸、单链核酸类似物或单链核酸和核酸类似物，且不与体系中的向导rna的导向序列杂交。
10.如权利要求6-9任一项所述的一种多重核酸检测方法的组合物/产品组合/试剂/试剂盒/系统，其特征在于，所述分子信标包括寡聚核苷酸及两端标记的荧光基团和淬灭基团，所述寡聚核苷酸两端为互补序列，所述寡聚核苷酸在非使用状态时通过两端的所述互补序列形成茎干区和环状区而保持发夹环构象，所述环状区是与所述第二核酸靶标序列互补的单链核酸；优选地，所述茎干区长度为5-10nt，所述环状区长度为15-35nt；优选地，所述分子信标的寡聚核苷酸为rna，或者所述分子信标的所述环状区为rna、所述茎干区为dna，或者所述环状区使用硫代修饰；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texas red、fitc、lc red640、rb200、ned、atto 425、quasar670、或其组合；所述淬灭基团选自下组：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse、mgb、或其组合；
11.一种crispr一管双重一步法检测体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
