本发明涉及医药，具体涉及一种预防肌腱粘连的纳米球载药系统及其制备方法和应用。
背景技术：
1、创伤或过度运动引起的肌腱损伤是一种常见的职业和运动性疾病。肌腱损伤进行修复术后极易发生与周围组织的粘连，严重影响患者的肢体功能康复，成为外科领域亟待解决的难题。
2、在肌腱周围包裹可吸收防粘连屏障材料是临床上广泛使用的预防肌腱粘连的方法。目前研究较多的可吸收膜包括聚-dl-乳酸医用膜、透明质酸膜、几丁糖膜等。但这些可吸收防粘连膜在临床使用中仍无法达到令人满意的效果，可能与其在体内抗拉强度差、容易破裂、无法靶向递送药物、载药率不高治疗效果有限等有关系。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提出一种预防肌腱粘连的纳米球载药系统及其制备方法和应用，粒径可调、分散性好、粒度均匀，且具有良好的力学性能、生物相容性和可降解性。在结构方面，其具有较好的空心结构和大比表面积效果，能够高效载药，促进靶向释放以及缓控释药，对促进愈合和预防、减少肌腱粘连具有较好的效果。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、本发明提供一种预防肌腱粘连的纳米球载药系统的制备方法，将骨髓间充质干细胞孵育培养后提取得到外泌体，包埋于介孔二氧化硅微球中，经过单宁酸与磁性粒子改性，吸附6-磷酸果糖二钠、骨形态发生蛋白组合物，得到的微球表面经过透明质酸-丝素蛋白肽包覆，制得预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
5、s1.外泌体的获得：将骨髓间充质干细胞加入mscm-sf培养基中，密度调整为106-107/ml并混合均匀，孵育培养7-10天后，采用超高速离心法结合超滤管法获得外泌体液；
6、s2.介孔包埋微球的制备：将正硅酸乙酯、致孔剂和油溶性乳化剂溶于乙酸乙酯中，滴入步骤s1中的外泌体液，乳化，调节溶液ph值，搅拌反应，离心，洗涤，常温干燥，制得介孔包埋微球；
7、s3.磁性粒子的制备：将氯化铁和氯化亚铁加入水中，惰性气体保护下，滴加氨水，加热搅拌反应，离心，洗涤，干燥，煅烧，制得磁性粒子；
8、s4.改性：将步骤s2制得的介孔包埋微球加入水中，加入步骤s3制得的磁性粒子、单宁酸和催化剂，加热搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得改性微球；
9、s5.药物溶液的制备：将6-磷酸果糖二钠、骨形态发生蛋白组合物溶于水中，搅拌混合均匀，制得药物溶液；
10、s6.载药：将步骤s4制得的改性微球加入步骤s5制得的药物溶液中，挥干溶剂，制得载药微球；
11、s7.透明质酸钠-丝素蛋白肽包覆：将透明质酸溶于水中，加入nhs和edc，搅拌活化反应，惰性气体保护下，加入丝素蛋白肽和步骤s6制得载药微球，搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
12、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述孵育培养的条件为在温度为36-38℃的含有4-6v/v％co2的恒温箱中孵育培养，所述超高速离心法结合超滤管法方法如下：将细胞液3-5℃、500-1000r/min离心10-15min除去细胞，然后3-5℃，3000-4000r/min离心15-20min除去细胞碎片等，超滤管浓缩上清液，3-5℃，12000-15000r/min离心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm滤膜过滤，最后3-5℃，30000-35000r/min离心60-70min，ph＝6.5-6.7的pbs重悬沉淀，3-5℃，30000-35000r/min再次离心60-70min，得到的沉淀即外泌体，用ph＝6.5-6.7的pbs溶液重悬，获得外泌体液；步骤s2中所述正硅酸乙酯、致孔剂、油溶性乳化剂、外泌体液的质量比为12-15:0.5-1:0.3-0.5:50，所述调节溶液ph值为7.3-7.7，所述搅拌反应的时间为10-12h，所述致孔剂选自十六烷基二甲基苄基氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化钠、十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种，所述油溶性乳化剂选自司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80、司盘-85中的至少一种。
13、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述氯化铁、氯化亚铁和氨水的质量比为3.2-3.3：1.2-1.3：2-4，所述加热搅拌反应的温度为60-70℃，时间为3-5h，所述煅烧的温度为700-800℃，时间为1-2h。
14、作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述介孔包埋微球、磁性粒子、单宁酸和催化剂的质量比为10:1-2：2-4:0.1-0.2，所述催化剂为ph＝8.5-9.5的tris-hcl溶液，所述加热搅拌反应的温度为40-50℃，时间为1-2h。
15、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述6-磷酸果糖、骨形态发生蛋白组合物的质量比为10:4-7，所述骨形态发生蛋白组合物为骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-14的混合物，质量比为5-7:3-5:1-2；步骤s6中所述改性微球、药物溶液的质量比为10：15-18。
16、作为本发明的进一步改进，步骤s7中所述透明质酸、nhs、edc、丝素蛋白肽和载药微球的质量比为15-20:5-7:3-6:7-10:20，所述活化反应的时间为0.5-1.5h，所述搅拌反应的时间为17-20h。
17、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
18、s1.外泌体的获得：将骨髓间充质干细胞加入mscm-sf培养基中，密度调整为106-107/ml并混合均匀，在温度为36-38℃的含有4-6v/v％co2的恒温箱中孵育培养7-10天后，采用超高速离心法结合超滤管法获得外泌体液；
19、所述超高速离心法结合超滤管法方法如下：将细胞液3-5℃、500-1000r/min离心10-15min除去细胞，然后3-5℃，3000-4000r/min离心15-20min除去细胞碎片等，超滤管浓缩上清液，3-5℃，12000-15000r/min离心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm滤膜过滤，最后3-5℃，30000-35000r/min离心60-70min，ph＝6.5-6.7的pbs重悬沉淀，3-5℃，30000-35000r/min再次离心60-70min，得到的沉淀即外泌体，用ph＝6.5-6.7的pbs溶液重悬，获得外泌体液；
20、s2.介孔包埋微球的制备：将12-15重量份正硅酸乙酯、0.5-1重量份致孔剂和0.3-0.5重量份油溶性乳化剂溶于乙酸乙酯中，滴入50重量份步骤s1中的外泌体液，乳化，调节溶液ph值为7.3-7.7，搅拌反应为10-12h，离心，洗涤，常温干燥，制得介孔包埋微球；
21、s3.磁性粒子的制备：将3.2-3.3重量份氯化铁和1.2-1.3重量份氯化亚铁加入水中，惰性气体保护下，滴加2-4重量份氨水，加热至60-70℃，搅拌反应3-5h，离心，洗涤，干燥，700-800℃煅烧1-2h，制得磁性粒子；
22、s4.改性：将10重量份步骤s2制得的介孔包埋微球加入水中，加入1-2重量份步骤s3制得的磁性粒子、2-4重量份单宁酸和0.1-0.2重量份催化剂，加热至40-50℃，搅拌反应1-2h，离心，洗涤，干燥，制得改性微球；
23、所述催化剂为ph＝8.5-9.5的tris-hcl溶液；
24、s5.药物溶液的制备：将10重量份6-磷酸果糖二钠、4-7重量份骨形态发生蛋白组合物溶于100重量份水中，搅拌混合均匀，制得药物溶液；
25、所述骨形态发生蛋白组合物为骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-14的混合物，质量比为5-7:3-5:1-2；
26、s6.载药：将10重量份步骤s4制得的改性微球加入15-18重量份步骤s5制得的药物溶液中，挥干溶剂，制得载药微球；
27、s7.透明质酸钠-丝素蛋白肽包覆：将15-20重量份透明质酸溶于水中，加入5-7重量份nhs和3-6重量份edc，搅拌活化反应0.5-1.5h，惰性气体保护下，加入7-10重量份丝素蛋白肽和20重量份步骤s6制得载药微球，搅拌反应17-20h，离心，洗涤，干燥，制得预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
28、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
29、本发明进一步保护一种上述预防肌腱粘连的纳米球载药系统在制备肌腱损伤进行修复术后预防肌腱粘连、促进愈合的药品中的应用。
30、本发明具有如下有益效果：
31、骨髓间充质干细胞存在于人体多种组织和脏器中，是一种多能干细胞，能快速增殖、分化为其他细胞组织的潜能，能够构建组织工程，其获得的外泌体能提供营养，促进骨组织修复，通过microrna调控诱导骨分化活性，减少术后的肌腱粘连。本发明将其进行复苏孵育，经过超高速离心法结合超滤管法获得得到外泌体液，包埋于介孔中空的二氧化硅纳米球中，介孔和纳米球结构具有较大的比表面积，通过化学沉积磁性四氧化三铁，能在外加磁场作用下，使载药的纳米球定向移动到修复部位，并将药物靶向缓控释释放，具有高效低毒的特点，同时，能产生磁场，促进愈合。
32、本发明制得磁性介孔包埋微球表面通过单宁酸负载改性后，单宁酸是一种富含邻苯二酚基团的分子，对药物分子表现出良好的粘附性，能够促进6-磷酸果糖二钠、骨形态发生蛋白组合物的粘附并将其吸附于微球的孔道中，起到缓控释释放的效果。
33、其中，6-磷酸果糖二钠能够促使肌腱细胞ⅰ型胶原产生量明显减少，从而降低了损伤肌腱术后出现粘连的情况，同时，还能不影响损伤肌腱的愈合速度及愈合质量。
34、骨形态发生蛋白具有促进骨、软骨及运动系统相关结缔组织的快速发生的能力，其中，骨形态发生蛋白-2成骨能力较强，诱导细胞快速增殖分化为其他细胞，对骨的生长和修复有积极作用，且有助于前体细胞定向分化为成骨细胞；骨形态发生蛋白-7增强骨膜细胞表达碱性磷酸酶的能力，可诱导骨膜细胞转化为成骨细胞；骨形态发生蛋白-14能促进形成软骨细胞，有助于脂肪干细胞分泌蛋白聚糖及胶原纤维，使得患者损伤肌腱断端抗张能力增强，增厚患者肌腱厚度。因此，本发明骨形态发生蛋白组合物能够促进骨生成，促进软骨细胞形成，促进干细胞成腱，减少粘连，促进患者快速愈合康复，具有协同增效的作用。
35、本发明将载药微球表面通过透明质酸和丝素蛋白肽反应包覆，透明质酸的羧基在nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和edc(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)的活化后，与丝素蛋白肽的氨基反应，形成酰胺键，从而实现交联，包覆于微球表面，形成壳层，同时，壳材透明质酸经过降解后，能够抑制粒细胞的游走和吞噬，减轻机体炎症介质，减少肌腱粘连的发生；同时，透明质酸还能够抑制纤维细胞的活性，增加血管内皮细胞，调节人体的微血管，参与肌腱的内源性修复过程，促进肌腱的康复。丝素蛋白肽和透明质酸还具有润滑作用，能够抑制炎症介质，减轻机体的痛感，为关节的活动功能的康复提供有利帮助。
36、本发明制备的纳米球粒径可调、分散性好、粒度均匀，且具有良好的力学性能、生物相容性和可降解性。在结构方面，其具有较好的空心结构和大比表面积效果，能够高效载药，促进靶向释放以及缓控释药，对促进愈合和预防、减少肌腱粘连具有较好的效果。
1.一种预防肌腱粘连的纳米球载药系统的制备方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞孵育培养后提取得到外泌体，包埋于介孔二氧化硅微球中，经过单宁酸与磁性粒子改性，吸附6-磷酸果糖二钠、骨形态发生蛋白组合物，得到的微球表面经过透明质酸-丝素蛋白肽包覆，制得预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述孵育培养的条件为在温度为36-38℃的含有4-6v/v％co2的恒温箱中孵育培养，所述超高速离心法结合超滤管法方法如下：将细胞液3-5℃、500-1000r/min离心10-15min除去细胞，然后3-5℃，3000-4000r/min离心15-20min除去细胞碎片等，超滤管浓缩上清液，3-5℃，12000-15000r/min离心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm滤膜过滤，最后3-5℃，30000-35000r/min离心60-70min，ph＝6.5-6.7的pbs重悬沉淀，3-5℃，30000-35000r/min再次离心60-70min，得到的沉淀即外泌体，用ph＝6.5-6.7的pbs溶液重悬，获得外泌体液；步骤s2中所述正硅酸乙酯、致孔剂、油溶性乳化剂、外泌体液的质量比为12-15:0.5-1:0.3-0.5:50，所述调节溶液ph值为7.3-7.7，所述搅拌反应的时间为10-12h，所述致孔剂选自十六烷基二甲基苄基氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化钠、十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种，所述油溶性乳化剂选自司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80、司盘-85中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述氯化铁、氯化亚铁和氨水的质量比为3.2-3.3：1.2-1.3：2-4，所述加热搅拌反应的温度为60-70℃，时间为3-5h，所述煅烧的温度为700-800℃，时间为1-2h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述介孔包埋微球、磁性粒子、单宁酸和催化剂的质量比为10:1-2：2-4:0.1-0.2，所述催化剂为ph＝8.5-9.5的tris-hcl溶液，所述加热搅拌反应的温度为40-50℃，时间为1-2h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s5中所述6-磷酸果糖、骨形态发生蛋白组合物的质量比为10:4-7，所述骨形态发生蛋白组合物为骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-14的混合物，质量比为5-7:3-5:1-2；步骤s6中所述改性微球、药物溶液的质量比为10：15-18。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s7中所述透明质酸、nhs、edc、丝素蛋白肽和载药微球的质量比为15-20:5-7:3-6:7-10:20，所述活化反应的时间为0.5-1.5h，所述搅拌反应的时间为17-20h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的预防肌腱粘连的纳米球载药系统。
10.一种如权利要求9所述预防肌腱粘连的纳米球载药系统在制备肌腱损伤进行修复术后预防肌腱粘连、促进愈合的药品中的应用。
