本发明涉及医药，具体涉及紫杉醇pm递送系统及其制备方法、评价方法。
背景技术：
1、紫杉醇ptx是常用的抗肿瘤药物之一，对多种肿瘤，包括卵巢癌、肺癌和乳腺癌都有显著的临床活性；临床使用的制剂大多具有副作用严重、稳定性低、药物释放快、缺乏肿瘤靶向能力等缺点；人们一直致力于开发有效的药物载体，如聚合物偶联物、脂质体和胶束；在这些给药系统中，聚合物胶束以其独特的核壳结构和高载药量而受到广泛关注；然而，许多负载ptx的胶束制剂在体内循环中存在稳定性低，药物释放快，缺乏肿瘤靶向能力的问题；
2、tat肽是一种具有特定氨基酸序列的细胞穿透肽cpps，有特殊的辅助跨质膜易位的能力，被广泛用于修饰抗癌药物载体，提高药物在肿瘤组织深处的蓄积；虽然cpps能够有效递送药物进入肿瘤细胞，但缺乏组织选择性和肿瘤靶向性，药物无法精准靶向，易造成对正常组织的损伤，提高cpps的肿瘤靶向性是应用于抗肿瘤的关键所在；
3、ingr肽可以特异性识别肿瘤新生血管内皮细胞上过表达的cd13受体，但缺乏穿透性，在肿瘤部位停留时间短，不能高效内化；sugahara等人设计的ingr靶向和渗透能力比ngr更强，可以使偶联的纳米颗粒进入肿瘤内部，提高疗效；
4、目前上市的聚合物胶束稳定性不高，靶向能力较差，容易进入到其他正常组织或器官中产生毒副作用；尽管将药物递送到肿瘤血管可以提高靶向效率，对肿瘤细胞的渗透性还有待改善；
5、综上所述，如何制备一种紫杉醇的递送系统，使其具有良好的靶向性以及药效，以及如何对该类药物进行药效检测评价，成为了待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供紫杉醇pm递送系统及其制备方法、评价方法，以解决以上的问题。
2、为达到以上目的，提供以下技术方案：
3、一种紫杉醇胶束递送系统，该递送系统的组分包括：
4、紫杉醇ptx、载体材料dspe-mpeg2000以及靶向肽；
5、其中，ptx与dspe-mpeg2000的质量比为1：20，靶向肽摩尔量为dspe-mpeg2000摩尔量的5％；
6、其中，靶向肽为ingr肽和tat肽中的至少一种。
7、本发明还提供了一种上述紫杉醇胶束递送系统的制备方法，包括以下步骤：
8、以1：20的质量比称取ptx、dspe-mpeg2000，分组，分别按照dspe-mpeg2000摩尔量的5％加入ingr肽、tat肽以及ingr肽和tat肽的混合物，分别加入茄形烧瓶中，加入4ml甲醇，超声溶解；在40℃下真空旋转蒸发30min，至形成透明均匀的脂膜，真空干燥过夜；加入4ml hepes缓冲液，在37℃下以50r/min的转速水化至溶液内自组装形成胶束状物，室温冷却后，用0.22μm滤膜过滤，得到ingr肽修饰的载ptx胶束ingr-ptx-pm，tat肽修饰的载ptx胶束tat-ptx-pm以及ingr肽、tat肽双修饰的载ptx胶束ingr/tat-ptx-pm，4℃保存备用；
9、其中，hepes缓冲液的ph＝7.4，浓度为0.1mo l/ml；
10、其中，ingr肽以及tat肽在自组装过程中修饰于胶束状物表面。
11、本发明还提供了一种上述紫杉醇pm递送系统的评价方法：
12、另制备获取bl ank-pm空白胶束以及ptx-pm载ptx胶束，备用；
13、评价方法包括以下步骤：
14、体外穿透效应检测评价：
15、s1：采用香豆素-6c6替换ptx，同法制备获取c6-pm载c6胶束、ingr肽修饰的载c6胶束ingr-c6-pm，tat肽修饰的载c6胶束tat-c6-pm以及ingr肽、tat肽双修饰的载c6胶束ingr/tat-c6-pm，另取游离香豆素free c6以及ht1080细胞，备用；
16、s2：取备用的ht1080细胞以2×104个/孔的密度接种于共聚焦玻底皿中，分组为实验组与对照组，实验组分别加入2ml含有free c6，c6-pm，ingr-c6-pm，tat-c6-pm，ingr/tat-c6-pm的无血清培养液，对照组加入无血清培养液，全部组别加入200μl无血清培养液稀释的hoechst33258染色，用共聚焦激光显微镜观测全部组别的ht1080细胞；
17、s3：取备用的ht1080细胞1.5×105个/孔的密度接种于六孔板中，分组为实验组与对照组，实验组分别加入2ml含有free c6，c6-pm，ingr-c6-pm，tat-c6-pm，ingr/tat-c6-pm的无血清培养液，对照组加入无血清培养液，全部组别消化，离心，流式上机检测；
18、s4：实验组分别加入2ml含有c6-pm，ingr-c6-pm，tat-c6-pm，ingr/tat-c6-pm的无血清培养液，对照组加入无血清培养液，实验组置于4℃环境下继续孵育1h，对照组放入培养箱中37℃孵育1h，其余与s3相同，进行细胞流式检测；
19、s5：实验组分别加入2ml含有c6-pm，ingr-c6-pm，tat-c6-pm，ingr/tat-c6-pm的无血清培养液，对照组加入无血清培养液，制成共7个平行试验批，每个平行试验批内的全部组别分别加入阿米洛利eipa、秋水仙碱co lch icine、氯丙嗪ch lorpromaz ine、氯喹chloroqu ine、制霉菌素nystat in、细胞松弛素d cytocha l as in d、动力蛋白抑制剂dynasore，其余与s3相同，进行细胞流式检测；
20、s6：取备用的ht1080细胞以2×104个/孔的密度接种于共聚焦玻底皿中，分组为实验组与对照组，实验组分别加入2ml含有free c6，c6-pm，ingr-c6-pm，tat-c6-pm，ingr/tat-c6-pm的无血清培养液，对照组加入无血清培养液，全部组别依次加入200μl无血清培养液稀释的lyso tracker、mito tracker、er tracker、ggr169-ceramide分别对溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体进行染色，全部组别加入200μl无血清培养液稀释的hoechst33258染色，用共聚焦激光显微镜观测全部组别的ht1080细胞；
21、其中，s1-s6全部实验组中的无血清培养液c6含量均为1μg/ml。
22、优选地，所述评价方法还包括以下步骤：
23、体外抗肿瘤效应检测评价：
24、步骤一：采用cck-8法，分别考察制剂free ptx，bl ank-pm，ptx-pm，ingr-ptx-pm，tat-ptx-pm，ingr/tat-ptx-pm对ht-1080细胞的毒作用；
25、步骤二：采用anneixin-v/fi tc染色法检测分别考察制剂free ptx，ptx-pm，ingr-ptx-pm，tat-ptx-pm，ingr/tat-ptx-pm对ht-1080细胞的凋亡能力；
26、步骤三：采用流式细胞术分别考察制剂free ptx，ptx-pm，ingr-ptx-pm，tat-ptx-pm，ingr/tat-ptx-pm对细胞周期的影响；
27、步骤四：采用流式细胞术分别考察制剂free ptx，ptx-pm，ingr-ptx-pm，tat-ptx-pm，ingr/tat-ptx-pm对细胞ros水平的影响；
28、步骤五：将ht1080细胞以1000个/孔的密度均匀接种于超低吸附96孔板中，培养3天至形成肿瘤球，分为实验组和对照组，实验组分别加入bl ank-pm，free ptx，ptx-pm，ingr-ptx-pm，tat-ptx-pm，ingr/tat-ptx-pm，对照组加入无血清培养液，连续镜下观测7天，测量肿瘤球体积及体积变化率；
29、步骤六：采用c6替换ptx，除去bl ank-pm实验组的全部组别进行激光共聚焦，分别加入act ion in cd13受体抑制剂与eg01377 nrp-1抑制剂中的至少一种，再次进行激光共聚焦，其余与步骤五相同，测定胶束穿透性。
30、优选地，所述评价方法还包括以下步骤：
31、体内穿透性检测评价：
32、步骤一：采用荧光染料dir替换ptx，同法制备得到free dir，dir-pm，ingr-dir-pm，tat-dir-pm，ingr/tat-dir-pm，备用；
33、步骤二：取ht-1080荷瘤小鼠裸鼠模型，将裸鼠分为6组，每组3只；利用ht-1080荷瘤小鼠裸鼠模型测定递送系统的体内穿透性；
34、其中，6组裸鼠分别配置为生理盐水给药组；free dir给药组；dir-pm给药组；ingr-dir-pm给药组；tat-dir-pm给药组；ingr/tat-dir-pm给药组，在1、2、4、8、12、24、36、48、72h时，使用异氟烷气体麻醉裸鼠，活体拍照，观察体内荧光分布情况。
35、优选地，所述评价方法还包括以下步骤：
36、取出各给药组的肿瘤组织和心、肝、脾、肺、肾，生理盐水漂洗，滤纸吸干，进行离体成像分析。
37、优选地，所述评价方法还包括以下步骤：
38、体内抗肿瘤效应检测评价：
39、s1：另取ht-1080荷瘤小鼠裸鼠模型，将裸鼠分为8组，每组6只；分别配置为生理盐水给药组；bl ank-pm给药组；taxo l给药组；白蛋白结合ptx给药组；ptx-pm给药组；ingr-ptx-pm给药组；tat-ptx-pm给药组；ingr/tat-ptx-pm给药组；每组给药剂量均为10mg/kg，此天定义为第0天；通过公式计算小鼠肿瘤体积，当给药天数为第12天时，取肿瘤，按照公式计算抑瘤率；
40、s2：另取肿瘤，进行肿瘤组织h&e染色；
41、s3：另取肿瘤，采用tunel法检测肿瘤组织细胞凋亡；
42、s4：另取肿瘤，进行免疫荧光分析；
43、安全性检测评价：
44、步骤一：从第0天起，计算体内抗肿瘤效应检测评价的s1中各组裸鼠模型的净体重变化值；
45、步骤二：计算体内抗肿瘤效应检测评价的s1中各组裸鼠模型的脏器重量占裸鼠模型体重的比例；
46、步骤三：测量第12天时体内抗肿瘤效应检测评价的s1中各组裸鼠模型的白蛋白alb，丙氨酸氨基转移酶alt，球蛋白glb，天门冬氨酸氨基转移酶ast，谷氨酰基转移酶ggt，总胆红素tbi l，尿素urea，肌酐crea。
47、本发明的有益效果为：
48、1.本发明设计了一种包载紫杉醇的纳米胶束，提高难溶性药物生物利用度，制得的胶束粒径较小，不易被网状内皮系统检测到；极大程度改善了药物递送，在增加生物利用度、稳定性、延长循环和缓释的同时降低ptx对全身组织、器官的毒副作用；
49、2.本发明选用dspe-mpeg2000作为胶束载体材料，具有亲水性聚乙二醇(peg)嵌段和疏水性二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)嵌段，可以自组装形成胶束结构；亲水的peg端形成胶束的外壳，避免受到吞噬细胞的摄取，而脂质的dspe端形成核心，可以包载更多的药物，改善了紫杉醇的溶解度，制得的纳米胶束粒径，pdi较小，可通过epr效应被动靶向至肿瘤部位；由于dspe-mpeg2000具有较长的脂肪酰基链，可以缓慢释放包载药物，提高了纳米胶束的稳定性和生物相容性，实现体内长循环；
50、3.本发明在紫杉醇纳米胶束上同时修饰靶向渗透肽ingr和细胞穿膜肽tat，可以克服肿瘤组织和细胞膜两种屏障；ingr特异性识别cd13受体并根据cendr规则剪切，在穿膜肽tat的协同作用下针对肿瘤多组织屏障，提高渗透能力；
51、4.本发明从二维水平的细胞实验和三维水平的肿瘤球实验共同评估了靶向肽和穿膜肽共同修饰的纳米胶束，多层次，多角度，更有力地证实了靶向肽和穿膜肽共同修饰的纳米递药系统可以提高胶束在肿瘤组织中的分布速度，加深药物蓄积，增强对肿瘤细胞的抑制。
1.一种紫杉醇胶束递送系统，其特征在于：该递送系统的组分包括：
2.一种如权利要求1所述的紫杉醇胶束递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.一种评价如权利要求2所述的一种紫杉醇胶束递送系统的制备方法制备得到的紫杉醇胶束递送系统的方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的一种紫杉醇胶束递送系统的评价方法，其特征在于：所述评价方法还包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种紫杉醇胶束递送系统的评价方法，其特征在于：所述评价方法还包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种紫杉醇胶束递送系统的评价方法，其特征在于：所述评价方法还包括以下步骤：
7.根据权利要求5所述的一种紫杉醇胶束递送系统的评价方法，其特征在于：所述评价方法还包括以下步骤：
