【】本发明涉及微生物和分子生物学领域，尤其是一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法。
背景技术
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背景技术：
1、生物胺是一类广泛存在于食品中的低分子量含氮有机化合物。根据结构可分为脂肪族(腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、胍丁胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺、多巴胺等)和杂环族(组胺、色胺、5-羟色胺等)三大类；根据组成成分又可分为单胺(腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、组胺、色胺等)和多胺(精胺、亚精胺、胍丁胺等)两大类。当生物胺在人体内积聚达到高水平时会产生毒性。除了其自身产生的毒性外，生物胺还能与亚硝酸盐反应生成致癌物亚硝胺、亚硝基吡咯烷等。当人体摄入过量的生物胺时会引起诸如头痛、恶心、呕吐腹泻、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。
2、食品中的生物胺主要是由微生物在发酵或成熟过程中由微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸而形成，氨基酸脱羧酶在5-磷酸吡哆醛为辅酶的条件下脱去氨基酸中的羧基后形成相应的胺，一些菌株可能含有多种氨基酸脱羧酶或者一种氨基酸脱羧酶可能对几种氨基酸都能产生脱羧作用。生物胺的产生依赖于生物胺前体物质-氨基酸、能分泌氨基酸脱羧酶的微生物以及适宜微生物产氨基酸脱羧酶的环境。能分泌氨基酸脱羧酶的微生物包括酵母、革兰氏阳性细菌(例如乳酸菌)、革兰氏阴性细菌等，其中乳酸菌被认为是产生物胺的主要微生物。在生物胺产生机制上，生物胺主要来源于相应氨基酸酸在脱羧酶作用下的脱羧反应，这些脱羧酶包括：组氨酸脱羧酶(hdc)、酪氨酸脱羧酶(tdc)赖氨酸脱羧酶(ldc)、鸟氨酸脱羧酶(odc)等。但腐胺的形成机制比较复杂，往往涉及鸟氨酸脱羧途径(odc)和胍丁胺脱氨途径(agdi)两条合成途径，前者在革兰氏阴性细菌(如enterobacteria和pseudomonads)或乳酸菌(lab)分泌的鸟氨酸脱羧酶作用下一步即可将鸟氨酸脱羧生成腐胺，后者需要先将精氨酸脱羧形成胍丁胺，接下来再经过胍丁胺脱亚氨酶系统将胍丁胺生成腐胺。不同微生物的脱羧能力各异，其脱羧能力不仅与物种有关，而且还与菌株和环境条件密切相关，因此通过检测脱羧酶基因、非脱羧酶基因及对微生物群落研究可以深入阐明生物胺的形成机理。
3、目前对生物胺脱羧酶基因的检测主要依赖dna杂交、普通pcr、定量pcr以及16srrna高通量测序方法，但采用16s rrna高通量测序方法研究生物胺脱羧酶基因的报道还不多见，特别是基于不经16srrna扩增的鸟枪宏基因组方法检测发酵食品中的产生物胺基因(包括脱羧酶基因、非脱羧酶基因)以及不依赖于纯培养方法鉴别产生物胺菌的的报道极其罕见。
4、腐乳和酱油是我国传统的发酵食品。腐乳和酱油的生产均以大豆为主要原料，通过微生物(人工添加或环境掺入)发酵而来，其过程较为复杂。由于发酵环境开放，周期较长，必然会积累大量微生物，这些微生物在发酵过程中对各种氨基酸进行脱羧等反应，最终导致生物胺的产生。然而，目前对这些发酵食品生产过程中的产生物胺基因以及生物胺形成机理的认识有待深入。
5、为此，本发明即针对上述问题而研究提出。
技术实现思路
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技术实现要素：
1、本发明目的是克服了现有技术的不足，提供一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，具有分析简便准确、高效、易操作的特点。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，包括如下步骤：
4、s1、发酵食品样品采集及保存，所述发酵食品样品包括商品腐乳样品和酱油酱醪样品，将发酵食品样品收集在收集装置上，并保存在-10℃～-35℃，直到进行dna提取和生物胺测定分析；
5、s2、生物胺分析，采用液相色谱法(hplc)对商品腐乳和酱油生产过程不同采样阶段酱醪样品中的生物胺进行分析，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺；
6、s3、样品基因组提取，采用试剂盒提取商品腐乳及酱醪的总dna，取样量0.1～2g；接着将复数个重复的dna样本合并后，储存在-10℃～-35℃；
7、s4、鸟枪宏基因组测序、组装及群落中生物胺基因分析，包括：
8、文库构建，使用covaris m220核酸超声波破碎仪将dna剪切成300bp～500bp的片段，然后使用nebnext ultra dna文库制备试剂盒制备测序文库；
9、测序构建，将s3中纯化后的dna进行建库测序，文库大小为350bp，用illuminanovaseq 6000platform进行pe150测序，产生2×150bp原始序列(reads)；
10、宏基因组序列组装及开放阅读框(orf)预测，原始序列(reads)用trimmomatic软件去除载体及低质量序列，采用megahit软件对所有样品有效reads进行混合组装，接着采用本地脚本统计序列组装参数；用bowtie2软件将原始序列(reads)比对到拼接好的contigs上，以去除序列长度小于500bp的contigs；采用metagenemark对保留的contigs进行orf预测，用cd-hit软件构建非冗余基因集；
11、样品群落中生物胺基因注释分析，对于涉及ba产生的基因的注释，当开放阅读框(orf)序列与涉及生物胺合成的京都基因和基因组百科全书(kegg)的序列相似性>30％且序列覆盖长度不小于95％时，该序列被认为是生物胺基因序列；使用bowtie2和默认参数，将腐乳和酱醪样品的单端reads映射到生物胺注释的orf上，以量化参与产生物胺基因的丰度；
12、s5、binning分析重建物种全基因组，将高质量原始序列(reads)用idba-ud软件进行宏基因组序列拼接，获得重叠群(contigs)；
13、后将原始序列(reads)比对到拼接好的contigs上bowtie2软件，去除序列长度小于1kb以及覆盖度coverage低于5的contigs；
14、使用concont软件进行contigs的宏基因组分箱(binning)归类，checkm检查每个contig clusters聚类里面的完整度及污染度情况，vizbin软件可视化重建物种全基因组的聚类结果；选取完整度completeness大于80％以及污染度contamination小于10％的mags作为高质量的优势微生物draft基因组草图序列；
15、优势物种的基因组草图序列用fraggenescan进行orf开放阅读框的预测；
16、s6、重建物种(mags)中的生物胺基因分析，每个mags的contigs序列经过orf预测，预测到的orf集合采用blastp(evalue 1e-5)比对kobas3.0自带的kegg数据库，比对的结果进行映射获得对应的生物胺基因kegg kid号列表，通过已知的生物胺的kids进行回帖，最终获取mags中生物胺相关基因信息。
17、如上所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，所述s2中，生物胺分析过程包括：
18、称取样品2g至50ml离心管中，加入20.00ml0.1 mol/l hcl水溶液，涡旋混匀；
19、接着置于高速冷冻离心机中，转速10000r/min，离心5min，取上清液过滤，滤液备用；
20、衍生化：取1.00ml滤液于10ml比色管，加入200μl 2mol/l的naoh水溶液，然后加入300μl的饱和nahco3，再加入1ml丹磺酰氯溶液，涡旋1min，置于42℃水浴锅中避光水浴45min，取出，再加入100μl氨水，再避光反应30min，取出至室温，用色谱纯乙腈定容至5.00ml，经0.45μm ptfe微孔滤膜过滤，进超高效液相色谱仪分析。
21、如上所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，所述s3中，采用试剂盒food dna kit提取商品腐乳及酱醪的总dna，取样量0.5g；之后用invitrogen qubit 2.0荧光定量仪和1％琼脂糖凝胶电泳测定dna的数量和质量，接着将三个重复的dna样本合并后，储存在-20℃下。
22、如上所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，所述s5中，优势微生物在不同处理条件下的丰度信息用mags的覆盖度coverage表征。
23、与现有技术相比较，本发明包括发酵食品样品采集及保存，生物胺分析，样品基因组提取，鸟枪宏基因组测序、组装及群落中生物胺基因分析，binning分析重建物种全基因组，重建物种(mags)中的生物胺基因分析等步骤，为此采用本发明能够准确且高效对发酵食品中产生物胺基因及物胺菌进行分析，具有分析简便准确、高效、易操作的特点，同时也能够准确高效地检测食品是否安全。
1.一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，其特征在于所述s2中，生物胺分析过程包括：
3.根据权利要求1所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，其特征在于所述s3中，采用试剂盒food dna kit提取商品腐乳及酱醪的总dna，取样量0.5g；之后用invitrogen qubit 2.0荧光定量仪和1％琼脂糖凝胶电泳测定dna的数量和质量，接着将三个重复的dna样本合并后，储存在-20℃下。
4.根据权利要求1所述一种分析发酵食品中产生物胺基因及产生物胺菌的方法，其特征在于所述s5中，优势微生物在不同处理条件下的丰度信息用mags的覆盖度coverage表征。
