本发明属于分析检测领域，涉及一种羰基功能化类石墨烯量子点及其制备方法与在检测碱性磷酸酶(alp)中的应用；更具体地，涉及一种基于羰基功能化类石墨烯量子点的比色传感器、比色/荧光双模传感器或借助试纸可视化检测碱性磷酸酶的方法。
背景技术：
1、天然酶具有活性高、选择性强、生物相容性好、反应温和等优点，在生物医学领域受到广泛关注。然而，由于天然酶存在成本高、易失活变性、难以在恶劣环境下操作、储存稳定性差、回收率低等缺点，天然酶在体外的应用前景受到严重限制。纳米酶是一类可模仿酶固有特性的生物仿生纳米材料，因其制备简单、可大规模生产、成本低、稳定性好、催化活性可调等优势，作为天然酶的潜在替代品受到了广泛关注，可拓展酶的实际应用。
2、随着纳米技术的快速发展，包括贵金属纳米颗粒、金属氧化物、金属有机框架(mofs)和碳基纳米酶在内的许多纳米酶被开发出来并应用于生物医学领域。其中，碳基纳米酶因其优越的电子和几何结构而成为研究的重点。碳基纳米酶是一类发展成熟的纳米酶，具有毒性低、价格低廉、稳定性高等优点，因此在生物分析、疾病诊断和治疗等各种生物医学应用中具有很强的吸引力。石墨烯量子点(gqds)是一种碳基纳米材料，同时具有石墨烯和碳点的独特性质。gqds不仅具有丰富的活性位点和良好的生物相容性，还具有很强的光致发光特性。研究表明，gqds可作为过氧化物酶的模拟物。然而，有关gqds的其他类酶活性的研究较少。因此，开发具有多种类似酶活性的gqds具有重大意义。
3、掺杂杂原子(n、p、s)和过渡金属(fe、cu、ce)是提高碳基纳米酶催化活性的一种成功方法。杂原子掺杂主要是通过提高载流子密度、热导率或电导率来增强碳基纳米分子的催化性能。并且由于n的原子半径与c相当，所以n通常被用作碳基纳米分子的掺杂剂。在碳基纳米酶中掺入金属可改善催化过程中的电子转移，从而提高反应速率。铁的掺杂通常会为羰基纳米分子提供更多的催化活性位点。同时，gqds在氧化脱氢反应中的活性位点和内在催化活性也被广泛研究。多项研究证明了碳纳米材料中氧官能团(羰基、羧基和羟基)在催化中的关键作用。其中，羰基对于提高催化活性尤为重要。因此，可以通过引入羰基来调控gqds的催化活性。然而合成氧功能化gqds通常需要高温和浓酸的条件下进行。而且大多数方法还会同时引入大量抑制gqds类过氧化物酶活性的羟基。因此，通过合理设计，开发一种更简单、更安全、更经济的制备方法合成具有显著酶活性的gqds具有重要意义。
4、碱性磷酸酶(alp)是一种重要的水解酶，广泛分布于人体血液和组织中，在蛋白质、核酸和其他生物大分子的磷酸盐代谢中起着关键作用。alp水平升高与多种疾病相关，包括骨病、前列腺癌和肝功能异常，可作为疾病诊断和预后的生物标志物。因此，准确评估alp活性水平意义重大。迄今为止，已经开发了多种用于alp水平定量分析的方法，包括比色法、荧光法、电化学法和表面增强拉曼散射法。在这些方法中，比色法凭借操作简单、可视化、灵敏度好、灵活性好等优点得到了最广泛的应用。在临床实践中，普遍采用经典的对硝基苯基磷酸(p-npp)测定法。然而，p-npp试验的灵敏度不足以测定低水平alp。因此，仍需探索更可靠、更灵敏的检测alp水平的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服传统石墨烯量子点的合成方法耗时、成本过高、合成条件要求高以及步骤繁琐的缺点，构建了一种通过简单温和的合成策略就可以制得的羰基功能化类石墨烯量子点，通过引入特定的含氧基团来增强纳米酶的生物催化特性，并且进一步建立了一种基于羰基功能化类石墨烯量子点的高灵敏度的比色传感器和高选择性的比色/荧光双信号传感器，可用于检测alp。
2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种羰基功能化类石墨烯量子点(o-gqds)，它是将选自聚苯胺(pani)、聚多巴胺(pda)或氧化石墨烯(go)的一种分散于超纯水中得到悬浮液，再加入双氧水和fe3o4纳米颗粒水分散液，水浴加热使上层溶液变成澄清，磁性分离除去fe3o4纳米粒、过滤，取上清液，上清液经微波加热处理得到的固体颗粒。
4、优选的，所述的悬浮液中聚苯胺、聚多巴胺或氧化石墨烯的浓度为5mg/ml。
5、优选的，将选自聚苯胺、聚多巴胺或氧化石墨烯的一种分散于超纯水中，进行超声处理，得到悬浮液。所述的超声处理的超声波功率为300w，时间为5～10分钟。
6、选自聚苯胺、聚多巴胺或氧化石墨烯的一种与fe3o4纳米颗粒的质量比为5:1～1:1，优选为2.5:1。
7、优选的，所述的双氧水的质量分数为30％。
8、优选的，所述的双氧水和fe3o4纳米颗粒水分散液的体积比为0.5:1～1:2，优选为1:1。
9、所述的水浴加热的温度为50～70℃，优选为60℃；
10、所述的水浴加热时间为3～5h，优选为4h。
11、所述的过滤采用0.45μm滤膜。
12、所述的微波加热处理在微波炉中进行，微波炉的功率为700w，微波加热时间为1～3分钟，优选为2分钟。
13、所述的原料为聚苯胺(pani)时，羰基功能化类石墨烯量子点记为b-fe-gqds；所述的原料为聚多巴胺(pda)时，羰基功能化类石墨烯量子点记为g-fe-gqds；所述的原料为氧化石墨烯(go)时，羰基功能化类石墨烯量子点记为y-fe-gqds。
14、一种基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，包括如下步骤：
15、步骤(a)、制备羰基功能化类石墨烯量子点；
16、步骤(b)、构建高灵敏度的碱性磷酸酶(alp)比色传感器：将不同浓度的alp、抗坏血酸-2-磷酸(aap)混合，进行孵育反应，加入abs缓冲溶液终止反应，加入羰基功能化类石墨烯量子点进行孵育反应，然后将上述混合溶液与双氧水和tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)混合，孵育反应，得到样品；以不含alp的体系作为空白对照样品；在550～750nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线，以alp的浓度为横坐标、样品与空白对照样品在652nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线；
17、步骤(c)、参照步骤(b)，测得未知alp浓度的待测样品在652nm处的吸光度值，获得样品与空白对照样品在652nm处的吸光度值的差值，代入步骤(b)的alp紫外标准曲线，得到待测样品中的alp浓度。
18、步骤(a)中，优选的，羰基功能化类石墨烯量子点为b-fe-gqds。
19、步骤(b)中，优选的，将不同浓度的alp溶液、抗坏血酸-2-磷酸(aap)溶液和tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，加入abs缓冲溶液终止反应，加入羰基功能化类石墨烯量子点分散液进行第二次孵育，然后将上述混合溶液与双氧水和tmb溶液混合得到第二孵育体系，进行第三次孵育反应，得到样品。
20、所述的第一孵育体系中，aap的终浓度为0.2～0.6mm，优选为0.4mm，alp的浓度为0.05～20u/l；所述的第二孵育体系中，羰基功能化类石墨烯量子点的终浓度为100mg/l～200mg/l，优选为160mg/l；h2o2的终浓度为8～12mm，优选为10mm；tmb的终浓度为4～6mm，优选为5mm。
21、所述的tris-hcl缓冲液为ph 7～8的tris-hcl缓冲液；考虑到ph 8是alp反应的最适ph，所述的tris-hcl缓冲液优选为ph 8、50mm的tris-hcl缓冲液；第一次孵育反应的温度为25～40℃，优选为37℃；第一次孵育反应的时间为10～30分钟，优选为15分钟。
22、第二次孵育反应的温度为25～40℃，优选为37℃；第二次孵育反应的时间为10～30分钟，优选为30分钟。
23、所述的abs缓冲液为ph 4～6的abs缓冲液，优选为ph 4、0.2mm的abs缓冲液。
24、第三次孵育反应的温度为25～40℃，优选为30℃；第三次孵育反应的时间为5～15分钟，优选为10分钟。
25、所述的第二孵育体系的终体积为200～350μl，优选为350μl。
26、具体的，所述的构建碱性磷酸酶(alp)比色传感器：将25μl不同浓度的alp溶液、10μl aap溶液和25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，加入250μl abs缓冲溶液终止反应；加入20μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液进行第二次孵育反应；将上述混合溶液与10μl双氧水、10μl tmb溶液混合得到第二孵育体系，进行第三次孵育反应，得到样品；以等体积tris-hcl缓冲液代替alp溶液，得到alp浓度为0u/l的体系作为空白对照样品；在550～750nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线；以alp的浓度为横坐标，样品与空白对照样品在652nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线。
27、步骤(c)中，具体的，样品检测：将25μl未知alp浓度的待测样品和10μl aap溶液和25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，体系中aap的终浓度为0.4mm，进行第一次孵育反应，加入250μl abs缓冲溶液终止反应；加入20μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液进行第二次孵育反应；将上述混合溶液与10μl双氧水、10μl tmb溶液和250μl abs缓冲溶液(ph 4.0，0.2mm)混合得到第二孵育体系，体系中羰基功能化类石墨烯量子点的终浓度为160mg/l，h2o2的终浓度为10mm，tmb的终浓度为5mm，进行第三次孵育反应，得到样品，得到样品；在550～750nm波长下测量样品的紫外吸收曲线，获得样品与空白对照样品在652nm处的吸光度值的差值，代入步骤(b)的alp紫外标准曲线，得到待测样品中的alp浓度。
28、作为本发明所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法的进一步优选技术方案，还包括：
29、步骤(d)、构建高选择性的alp比色/荧光双模传感器：将不同浓度的alp和aap混合，进行孵育反应，将上述混合溶液与羰基功能化类石墨烯量子点混合，进行孵育反应得到样品，以不含alp的体系作为空白对照样品；在350～550nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线，以alp的浓度为横坐标、样品和空白对照样品在450nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线；在365nm的激发下测量样品和空白对照样品在400～650nm波长的荧光发射曲线，以alp的浓度为横坐标、样品和空白对照样品在450nm处的荧光强度值的差值为纵坐标，建立alp荧光标准曲线；
30、步骤(e)、样品检测：参照步骤(d)测得未知alp浓度的待测样品在450nm处的吸光度值和450nm处的荧光强度值，获得样品与空白对照样品在450nm处的吸光度值的差值，代入步骤(d)的alp紫外标准曲线，或获得样品与空白对照样品在450nm处的荧光强度值的差值，代入步骤(a)的alp荧光标准曲线，得到待测样品中的alp浓度。
31、步骤(d)中，将不同浓度的alp溶液、aap溶液和tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，将上述混合溶液与羰基功能化类石墨烯量子点分散液、tris-hcl缓冲液混合得到第二孵育体系，进行第二次孵育反应，得到样品。
32、所述的第一孵育体系中，aap的终浓度为2.3～6mm，优选为4mm，alp的终浓度为0.5～20u/l；alp溶液的体积为第二孵育体系终体积的1/10。
33、第一孵育体系中，采用的tris-hcl缓冲液为ph 7～8的tris-hcl缓冲液，优选为ph8、50mmtris-hcl缓冲液。
34、第一次孵育反应的温度为25～40℃，优选为37℃；第一次孵育反应的时间为10～50分钟，优选为25～30分钟，进一步优选为30分钟。
35、第二孵育体系中，羰基功能化类石墨烯量子点的终浓度为500mg/l～600mg/l，优选为560mg/l。
36、所述的混合溶液与羰基功能化类石墨烯量子点混合时，加入的tris-hcl缓冲液为ph7～8的tris-hcl缓冲液；考虑到ph7是羰基功能化类石墨烯量子点和aap结合适宜的ph，优选ph7、50mm的tris-hcl缓冲液。所述的孵育体系的终体积为200～300μl，优选为250μl；。
37、第二次孵育反应的温度为25～40℃，优选为30℃；第二次孵育反应的时间为10～50分钟，优选为10～30分钟，进一步优选为15分钟。
38、具体的，所述的构建高选择性的alp比色/荧光双模传感器：将25μl不同浓度的alp溶液、aap溶液和25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应；将上述混合溶液与70μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液、120μl tris-hcl缓冲液混合得到第二孵育体系，进行第二次孵育反应；以等体积tris-hcl缓冲液代替alp溶液，得到空白对照样品；在350～550nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线，以alp的浓度为横坐标、样品与空白对照样品在450nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线；在365nm的激发光下测量样品和空白对照样品在400～650nm波长的荧光发射曲线，以alp的浓度为横坐标、样品和空白对照样品在450nm处的荧光强度值的差值为纵坐标，建立alp荧光标准曲线。
39、步骤(e)中，具体的，所述的样品检测：将25μl未知alp浓度的待测样品和10μl aap溶液、25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，体系中aap的终浓度为4mm，进行第一次孵育反应；将上述混合溶液与70μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液和120μl tris-hcl缓冲液混合得到第二孵育体系，进行第二次孵育反应；测得样品在450nm处的最大紫外吸光度值和450nm处的荧光强度值，获得样品与空白对照样品在450nm处的紫外吸光度值的的差值，代入步骤(d)的alp紫外标准曲线，或获得样品与空白对照样品在450nm处的荧光强度值的差值，代入步骤(d)的alp荧光标准曲线，得到待测样品中的alp浓度。
40、作为本发明所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法的进一步优选方案，还包括：
41、步骤(f)、基于纸基的可视化检测：将羰基功能化类石墨烯量子点和aap混合，分散在tris-hcl缓冲液中得到反应基质；将反应基质喷洒在滤纸上，滤纸干燥，得到功能化检测试纸；在功能化检测试纸上滴加等体积不同浓度的alp溶液，室温反应，观察颜色变化，随着alp浓度的升高，试纸的颜色呈现由深变浅的变化趋势，基于不同alp浓度对应不同的颜色构建比色卡；
42、步骤(g)、样品检测：参照步骤(f)，将未知alp浓度的待测样品滴加到功能化检测试纸上，室温反应，观察试纸的颜色，与比色卡比对，得到待测样品中alp的大致水平。
43、步骤(f)中，所述的tris-hcl缓冲液为ph8的tris-hcl缓冲液。
44、所述的反应基质中，aap的终浓度为3～5mm，优选为4mm；羰基功能化类石墨烯量子点的终浓度为250mg/l～350mg/l，优选为300mg/l。
45、所述的滤纸为圆形滤纸；圆形滤纸的直径为1厘米。
46、所述的alp溶液采用ph 8的tris-hcl缓冲液配制。
47、所述的干燥在真空干燥箱中进行；所述的干燥的温度为35～50℃，优选为37℃；干燥的时间为10～40分钟，优选为30分钟。
48、所述的alp溶液的体积为25μl，浓度为0～240u/l。所述的反应的时间为20～40分钟，优选为30分钟。
49、所述的待测样品为正常人血清样品。待测样品预处理：将血清样本与10％三氯乙酸(tca)按体积比1:1混合，在冰水浴中冷却10分钟以沉淀血清中的蛋白质并消除其干扰，12000rpm离心15分钟，得到上清液，加入naoh溶液(1mm)调节ph值至8。
50、所述的alp溶液采用tris-hcl缓冲液配制，优选采用ph 8的tris-hcl缓冲液配制。
51、所述的抗坏血酸-2-磷酸(aap)溶液采用超纯水配制。
52、所述的羰基功能化类石墨烯量子点分散液采用超纯水配制。
53、所述的tmb溶液采用超纯水配制。
54、本发明比色传感器的检测机理为(图1)：羰基功能化类石墨烯量子点如b-fe-gqds具有过氧化物酶活性，在h2o2存在时可以氧化tmb生成氧化tmb(oxtmb)，从而使溶液由无色变为蓝色，在652nm处可看到明显的紫外吸收峰。加入aap后，aap会和b-fe-gqds结合抑制其过氧化物酶活性。然而，alp可以通过水解aap的磷酸基团，恢复b-fe-gqds的催化活性。此外，b-fe-gqds还具有抗坏血酸氧化酶活性，可以抵消水解产物aa对系统的影响。
55、本发明比色/荧光传感器的检测机理为(图2)：当等羰基功能化类石墨烯量子点如b-fe-gqds和aap共存时，溶液由无色变为棕色，在450nm处可看到明显的紫外吸收峰。然而，当引入alp时，alp可催化aap的磷酸基团水解形成抗坏血酸(aa)，从而导致紫外吸光度下降。相反，b-fe-gqds的荧光在单独加入aap后猝灭。但是，当同时存在aap和alp时，可以观察到明显的荧光恢复。
56、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
57、1、纳米材料的单一酶样活性已在文献中被广泛报道。然而具有多种酶模拟物的纳米酶在检测中具有更广泛的应用前景。本发明羰基功能化类石墨烯量子点具有类过氧化物酶和类抗坏血酸氧化酶活性双重酶活性。
58、2、本研究不仅构建了高灵敏度的比色传感器，还构建了荧光/比色双模传感器，其具有更高的准确性，可以应用采集的不同信号来降低假阳性和阴性结果的发生率。
1.一种羰基功能化类石墨烯量子点，其特征在于：它是将选自聚苯胺、聚多巴胺或氧化石墨烯的一种分散于超纯水中得到悬浮液，再加入双氧水和fe3o4纳米颗粒水分散液，水浴加热使上层溶液变成澄清，磁性分离除去fe3o4纳米粒、过滤，取上清液，上清液经微波加热处理得到的固体颗粒。
2.根据权利要求1所述的羰基功能化类石墨烯量子点，其特征在于：所述的悬浮液中聚苯胺、聚多巴胺或氧化石墨烯的浓度为5mg/ml；
3.一种基于权利要求1所述的羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤(b)中，将不同浓度的alp溶液、抗坏血酸-2-磷酸溶液和tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，加入abs缓冲溶液终止反应，加入羰基功能化类石墨烯量子点分散液进行第二次孵育，然后将上述混合溶液与双氧水和tmb溶液混合得到第二孵育体系，进行第三次孵育反应，得到样品；
5.根据权利要求3或4所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述的构建碱性磷酸酶比色传感器：将25μl不同浓度的alp溶液、10μl aap溶液和25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，加入250μl abs缓冲溶液终止反应；加入20μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液进行第二次孵育反应；将上述混合溶液与10μl双氧水、10μl tmb溶液混合得到第二孵育体系，进行第三次孵育反应，得到样品；以等体积tris-hcl缓冲液代替alp溶液，得到alp浓度为0u/l的体系作为空白对照样品；在550～750nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线；以alp的浓度为横坐标，样品与空白对照样品在652nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线。
6.一种基于权利要求1所述的羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：包括：
7.根据权利要求6所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤(d)中，将不同浓度的alp溶液、aap溶液和tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应，将上述混合溶液与羰基功能化类石墨烯量子点分散液、tris-hcl缓冲液混合得到第二孵育体系，进行第二次孵育反应，得到样品；
8.根据权利要求6或7所述的基于羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：所述的构建高选择性的alp比色/荧光双模传感器：将25μl不同浓度的alp溶液、aap溶液和25μl tris-hcl缓冲液混合得到第一孵育体系，进行第一次孵育反应；将上述混合溶液与70μl羰基功能化类石墨烯量子点分散液、120μl tris-hcl缓冲液混合得到第二孵育体系，进行第二次孵育反应；以等体积tris-hcl缓冲液代替alp溶液，得到空白对照样品；在350～550nm波长下测量样品和空白对照样品的紫外吸收曲线，以alp的浓度为横坐标、样品与空白对照样品在450nm处的吸光度值的差值为纵坐标，建立alp紫外标准曲线；在365nm的激发光下测量样品和空白对照样品在400～650nm波长的荧光发射曲线，以alp的浓度为横坐标、样品和空白对照样品在450nm处的荧光强度值的差值为纵坐标，建立alp荧光标准曲线。
9.一种基于权利要求1所述的羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：包括：
10.根据权利要求9所述的羰基功能化类石墨烯量子点检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤(f)中，所述的tris-hcl缓冲液为ph8的tris-hcl缓冲液；
