本发明属于荧光染料，具体涉及到几种荧光染料的制备方法和应用，特别涉及到其在制备具有线粒体特异性的免洗荧光纳米探针中的应用。
背景技术：
1、线粒体是具有双层膜结构的细胞器，存在于大多数真核细胞中。线粒体内膜通过运输质子（h+）而形成负电位，维持着线粒体内外的电化学梯度。作为细胞内的“动力车间”，线粒体负责产生atp，为细胞内的各种生命活动供给能量。此外，线粒体在许多生理过程中具有重要作用，包括细胞代谢、信号传导、细胞增殖分化和程序性死亡等。现有研究表明，线粒体功能障碍和多种人类疾病密切相关，如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等。但是，线粒体的许多活动和相关机制仍是一个谜，因此，开发相关的线粒体可视化工具是一项重要的工作。
2、荧光成像作为一种重要的生物成像技术，具有特异性高、实时监测、无创等独特优势，已经广泛应用于生命科学研究、医学诊断和药物开发等领域。但是，现有技术中适用于线粒体染色的荧光探针和商业化探针通常存在明显缺陷，即染色后需要三次以上洗涤。染色后的清洗为了去除游离染料的强残留荧光从而获得信噪比的图像，这会延长数据获取的时间并且操作繁琐，增加了操作中的不确定因素。所以，开发免洗的荧光探针具有重大意义。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本发明的主要目的在于提供几种线粒体特异性的免洗荧光纳米探针，同时提供其制备方法。得益于聚集荧光淬灭（acq效应）和分子中的离域亲脂性阳离子结构，制成氟硼二吡咯（bodipy）纳米制剂荧光淬灭，被细胞摄取后，纳米颗粒解离发出强荧光信号，并在具有负电位的线粒体内膜上聚集，使之能够应用于线粒体的特异性免洗成像。
2、本发明采用如下技术方案：
3、一种免洗荧光纳米探针，其化学结构式如下所示：
4、。
5、其中，r1为含磷的芳香基团或者杂环基团、含氮的芳香基团或者杂环基团、含氮的烷基；优选的，r1为以下基团中的一种：
6、；
7、其中，x为卤素，n为1～20；优选的，卤素为氯、溴或碘，n为1～11；
8、r2、r3独立的选自氢、含磷和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的烷基；优选的，r2、r3独立的选自氢或以下基团中的一种：
9、；
10、其中，x为卤素，m为1～20；优选的，卤素为氯、溴或碘，m为2～12；
11、r4为氢或者烷基；优选的，r4中，烷基的碳原子数为1～6，比如甲基；
12、r5为氢或者烷基；优选的，r5中，烷基的碳原子数为1～6，比如乙基。
13、优选的，上述免洗荧光纳米探针的化学结构式如下：
14、
15、进一步优选的是，上述免洗荧光纳米探针为bdp-tpp或bdp-tma或bdp-ima：
16、
17、本发明公开了上述免洗荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
18、（1）将化合物1、含磷的芳香或者杂环化合物反应，得到所述免洗荧光纳米探针；
19、（2）将化合物1、含氮的芳香或者杂环化合物反应，得到所述免洗荧光纳米探针；
20、（3）将化合物1、含氮的烷基化合物反应，得到所述免洗荧光纳米探针；
21、化合物1的化学结构式如下：
22、；
23、其中，x为卤素，n为1～20；
24、r4为氢或者烷基；r5为氢或者烷基；r6、r7独立的选自氢、卤代烷氧基。
25、优选的，卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；比如，卤代烷氧基如下：
26、
27、其中，x为卤素，比如氯、溴、碘，n为1～20，优选2～12。
28、上述技术方案中，含磷的芳香化合物包括三苯基膦；含氮的杂环化合物包括1-甲基咪唑；含氮的烷基化合物包括三甲胺；卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；烷基中，碳原子数为1～6。
29、本发明还提供上述探针为bdp-tpp的制备方法，步骤如下：将化合物1与三苯基膦反应，得到带正电的光敏剂bdp-tpp。优选的是，反应溶剂为乙腈。
30、本发明还提供上述探针为bdp-tpp、bdp-tma或bdp-ima的的制备方法，步骤如下：将化合物1分别与三苯基膦、三甲胺或1-甲基咪唑反应，得到bodpy光敏剂bdp-tpp、bdp-tma或bdp-ima。优选的是，bdp-tma制备反应的溶剂为乙醇，bdp-tpp和bdp-ima制备反应的溶剂为乙腈。
31、本发明公开了上述免洗荧光纳米探针在作为或者制备探针中的应用。
32、本发明公开了上述免洗荧光纳米探针在作为或者制备细胞成像试剂中的应用。
33、优选的，所述免洗荧光纳米探针具有线粒体特异性。
34、本发明公开了一种纳米制剂，包括上述免洗荧光纳米探针。
35、本发明公开了上述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤，将上述免洗荧光纳米探针有机溶剂溶液与水混合，再除去有机溶剂，得到纳米制剂。优选的，有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇中的一种或几种。
36、本发明将上述免洗荧光纳米探针溶解在有机溶剂中，得到有机溶液，将溶液以滴入超纯水，室温下搅拌至有机溶剂完全挥发，得到的溶液即为纳米制剂。优选的是，所述有机溶液中，上述免洗荧光纳米探针的浓度为0.2~2mg/ml；
37、优选的是，所述有机溶液和超纯水的体积比为1：（2~10）。
38、优选的是，所述纳米制剂中，免洗荧光纳米探针的终浓度为50～200µg/ml。
39、本发明公开了上述纳米制剂在作为或者制备细胞成像试剂中的应用。
40、优选的是上述应用至少包括以下一项：
41、（1）上述免洗荧光纳米探针或纳米制剂在培养荧光细胞中的应用；
42、（2）上述免洗荧光纳米探针或纳米制剂在制备培养荧光细胞的培养基中的应用；
43、（3）上述免洗荧光纳米探针或纳米制剂在线粒体定位中的应用；
44、（4）上述免洗荧光纳米探针或纳米制剂在细胞激光共聚焦成像中的应用。
45、优选的是，可对多种细胞系线粒体进行免洗染色，具有普适性。
46、优选的是，所述多种细胞系包括但不限于hela细胞、4t1细胞、b16-f10细胞等。
47、有益效果：
48、1.本发明中使用的免洗荧光纳米探针结构简单，合成容易，生产成本低。
49、2.本发明成功开发了几种具有线粒体特异性的免洗荧光纳米探针。得益于聚集荧光淬灭（acq效应）和分子中的离域亲脂性阳离子结构，制成纳米制剂的bodpy衍生物荧光淬灭，被细胞摄取后，纳米颗粒解离发出强荧光信号，并在具有负电位的线粒体内膜上聚集，使之能够应用于线粒体的特异性免洗成像，且具有良好的生物相容性，在细胞器成像领域具有极大的应用价值。
1.一种免洗荧光纳米探针，其特征在于，所述免洗荧光纳米探针的化学结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述免洗荧光纳米探针，其特征在于，r1为以下基团中的一种：
3.权利要求1所述免洗荧光纳米探针在作为或者制备探针中的应用。
4.权利要求1所述免洗荧光纳米探针在作为或者制备细胞成像试剂中的应用。
5.根据权利要求3或者4所述的应用，其特征在于，所述免洗荧光纳米探针具有线粒体特异性。
6.权利要求1所述免洗荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述免洗荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，含磷的芳香化合物包括三苯基膦；含氮的杂环化合物包括1-甲基咪唑；含氮的烷基化合物包括三甲胺；卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；烷基中，碳原子数为1～6。
8.一种纳米制剂，包括权利要求1所述免洗荧光纳米探针。
9.权利要求8所述纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将权利要求1所述免洗荧光纳米探针有机溶剂溶液与水混合，再除去有机溶剂，得到纳米制剂。
10.权利要求8所述纳米制剂在作为或者制备细胞成像试剂中的应用。
