本发明属于检测，尤其涉及基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、循环肿瘤dna（ctdna）通常是由癌细胞在生理活动中释放至血液循环系统中携带一定特征（如突变、缺失、插入等）的dna片段，长度约为132~145 bp。迄今为止，研究人员在绝大多数癌症中均发现了ctdna突变，且与肿瘤分期成正相关。目前关于ctdna突变检测方法主要有二代测序技术（ngs）、beaming技术和微滴式数字pcr等，这些技术存在对操作人员的专业性要求苛刻、操作繁琐、假阳性等问题，从而阻碍了以上检测方法的应用，无法满足大批量样本快速检测的需求。
2、表面增强拉曼光谱（sers）技术具有谱峰窄而尖锐、高灵敏度、高选择性等优点，可通过编码技术实现短时间内对多个目标物进行检测，以克服上述方法中易受光漂白、耗时、操作繁琐等问题。随着便携式拉曼光谱仪的飞速发展，已有大量研究设计了各类基于sers生物传感器的试剂盒，并利用便携式拉曼光谱仪进行检测，克服了上述方法设备要求和操作人员要求高等问题。为了实现快速、即时、便捷、高灵敏地对ctdna突变进行检测，本发明设计了一种包含sers生物传感芯片和特异性探针的基因检测试剂盒。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒及其应用，实现超灵敏、准确、短时间地确定复杂样本中ctdna的突变类型。
2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
3、基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，所述试剂盒包括发卡dna-a链功能化的编码银包金纳米粒子（au@reporter@ag nps）和发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片。
4、所述的发卡dna-a链功能化的编码银包金纳米粒子（au@reporter@ag nps）的制备方法如下：首先，将1 mm拉曼标记分子（reporter）按体积比 1:1000 加入金纳米粒子（aunps）溶液中且在室温下反应2 h，以9000 rpm，10 min 离心并以超纯水重悬，随后依次以与au nps 的体积比为1: 100、1: 50、 1: 10、1: 10的体积比的比例加入 1% 柠檬酸钠溶液、0.1 m氢氧化钠溶液、1 mm硝酸银溶液和 10 mm 抗坏血酸溶液，在室温下反应0.5 h，以8500 rpm，8 min 离心并以超纯水重悬，得au@reporter@ag nps。最后，均按体积比1: 100间隔20 min依次加入10 μm 发卡dna-a溶液、pbs（1x）溶液、0.02 m氯化钠溶液和0.1 m氯化钠溶液，于4℃静置10-18h，以8000 rpm，6 min离心并以0.1 mm pbs重悬，得发卡dna-a链功能化的编码au@reporter@ag nps。
5、所述的发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片的制备方法为：制备具有自校准功能的pdms@ag二维凹槽基板，并以发卡dna-b结构进行功能化，具体如下：首先，将sylgard 184试剂和固化剂以10:1混合后浇铸到聚苯乙烯模具上，在80℃下加热1.5 h，脱模后得带有正方形凹槽的pdms芯片；随后，将pdms芯片转移至0.1 %wt ~ 10 %wt 3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）溶液中浸泡12 h，以超纯水和乙醇反复冲洗，室温下干燥得pdms-aptes芯片；然后，将pdms芯片转转移至种子液中浸泡2 ~ 12 h，使用超纯水清洗多余溶液后，再转移至生长液中浸泡0.5 ~ 4 h，以超纯水清洗后，得pdms-ag 芯片；最后，将发卡dna-b链、pbs（1x）溶液、0.02 m和0.1 m氯化钠溶液依次加入pdms-ag 芯片的方形凹槽中，4℃10-18h，使用0.1mm pbs溶液清洗凹槽，得发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片。
6、进一步地，所述的发卡dna-a链和发卡dna-b链根据ctdna的突变序列设计。
7、进一步地，所述的reporter可以是4-巯基苯甲酸（tfmba）、2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸（mmtaa）、4-巯基苯硼酸（mpba）、2,3,5,6-四氟-4-巯基苯甲酸（tfmba）等任意一种。
8、进一步地，发卡dna-a链和发卡dna-b链均需以95℃，5 min退火，并在室温下自然冷却后分别修饰在编码au@reporter@ag nps和pdms-ag芯片凹槽表面上。
9、进一步地，所述的聚苯乙烯模具是由0.2 ×0.2×0.25 cm的正方体以0.72 cm间隔排布在7 ×5×0.25 cm的长方体底座上组成。聚苯乙烯模具中正方体的大小可根据实际需求进行调整。
10、进一步地，所述的aptes溶液由超纯水/乙醇混合液（v/v=1:1）配制得到。
11、进一步地，所述的种子液组成为1% 柠檬酸钠溶液、1 mm 硝酸银溶液和1 mm抗坏血酸溶液（v/v/v=1:1:1）。
12、进一步地，所述的生长液组成为1% 柠檬酸钠溶液、10 mm 硝酸银溶液和10 mm抗坏血酸溶液（v/v/v=1:1:1）。
13、进一步地，发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片的凹槽以hs-peg (10 μm)孵育0.5h，以封闭多余位点，减少非特异性吸附。
14、进一步地，pdms芯片上可原位合成其他形貌及材质的贵金属纳米粒子，包括银纳米线、金纳米球粒子等。
15、本发明还提供了一种基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒来检测实际样本的方法，包括以下步骤：
16、s1：将不同浓度（0 ~ 10 nm）的标准品溶液与发卡dn-a链功能化的编码au@reporter@ag nps以1: 1 (v/v) 混合加入发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片的凹槽内，于37 ℃孵育0.5 ~ 3 h，以超纯水反复清洗后，借助便携式拉曼光谱仪收集光谱信息。以reporter特征峰的拉曼强度与pdms-ag 芯片位于静默区的拉曼特征峰强度比值构建标准品的工作曲线。
17、s2：实际样本需先采取解旋处理：先后将实际样本以95 ℃和0 ℃孵育10 min，得ssdna，后续按照步骤s1进行。收集实际样本的拉曼强度比值，根据标准品工作曲线计算相应浓度。
18、本发明采用以上技术方案，制备具有自校准功能的pdms@ag二维凹槽基板，以种子法制备具有拉曼信号分子的金包银纳米粒子，然后根据ctdna的突变序列设计相应的发卡dna结构，并分别修饰在银包金纳米粒子和pdms@ag二维凹槽基板表面，以构建循环放大系统，实现对ctdna突变基因的定量检测。
19、本发明所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒检测实际样本的工作原理（图1）为：当存在目标ssdna时，目标链ssdna与发卡dna-a结构的互补碱基数量多于发卡dna-a结构本身结合的茎环部分，从而将该发卡结构打开，形成双链。由于发卡dna-b结构与发卡dna-a结构存在更多的互补碱基数，从而以竞争性结合取代目标ssdna，而释放的目标ssdna诱导下一个周期，即无酶等温循环放大反应（cha）。其中，发卡dna-a和发卡dna-b结构形成了稳定的双链，进而将发卡dna-a功能化的编码au@reporter@ag nps捕获在发卡dna-b功能化的pdms-ag芯片凹槽的表面上，因此编码au@reporter@ag nps的捕获数量与目标ssdna的浓度成正相关。我们根据编码au@reporter@ag nps中特征峰强度与pdms-ag芯片位于静默区的特征峰强度比值构建标准工作曲线或计算目标链的浓度。相反地，如不存在目标ssdna时，发卡dna-a结构无法打开，无法开启无酶等温循环放大反应，即无发卡dna-a功能化的编码au@reporter@ag nps存在发卡dna-b功能化的pdms-ag芯片凹槽的表面上。
20、本发明的有益效果在于：1）以原位合成的方式在pdms上修饰具有sers活性的等离子体粒子，可提供“热点”，通过与发卡dna-a链功能化的编码au@reporter@ag nps形成耦合效应，提高检测灵敏度。2）以pdms自带的位于静默区的拉曼信号特征峰，一方面大多数样本包括生物样本的拉曼峰多位于生物拉曼区，采用静默区信号可减少峰位重叠等干扰；另一方面，以静默区拉曼信号作为校准峰，可校正仪器等物理环境来的信号波动，因此以pdms-ag 芯片作为基板可提高检测的准确度。3）利用cha反应进一步地将sers增强模型的信号进行放大，极大程度地提高了检测的灵敏度，加之基于发卡dna结构的高特异性，利用该模型可实现在复杂生物样本中超灵敏地检测出ctdna的突变类型。
1.基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括发卡dna-a链功能化的编码银包金纳米粒子和发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片，
2.根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的发卡dna-a链和发卡dna-b链根据ctdna的突变序列设计。
3.根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的拉曼标记分子为4-巯基苯甲酸、2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸、4-巯基苯硼酸、2,3,5,6-四氟-4-巯基苯甲酸中的任意一种。
4. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的发卡dna- a链和发卡dna-b a链均需经过95 ℃加热5 min退火变性，在室温下自然冷却后使用。
5. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的聚苯乙烯模具是由0.2 ×0.2×0.25 cm的正方体以0.72 cm间隔排布在7×5×0.25 cm的长方体底座上。
6. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的sylgard 184试剂和固化剂的体积比为10:1。
7. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的种子液由1%的柠檬酸钠溶液、1 mm的硝酸银溶液和1 mm的抗坏血酸溶液以体积比1:1:1组成。
8. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述的生长液由1%的柠檬酸钠溶液、10 mm的硝酸银溶液和10 mm的抗坏血酸溶液以体积比1:1:1组成。
9. 根据权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒，其特征在于，以hs-peg溶液封闭发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片正方形凹槽表面0.5 ~0.6h，以减少非特异性免疫。
10. 如权利要求1所述的基于sers生物传感芯片的ctdna突变基因检测试剂盒在检测实际样本中的应用，其特征在于，将实际样本和发卡dna-a链功能化的编码au@reporter@agnps滴入发卡dna-b链功能化的pdms-ag芯片的正方形凹槽中，于37℃下孵育0.5 ~ 3h后，使用超纯水清洗数次，利用便携式拉曼光谱仪收集相应拉曼光谱。
