(一)本发明涉及一种生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法。
背景技术：
0、(二)背景技术
1、山茶油具有与橄榄油相似的物理化学性质和脂肪酸组成，因此被誉为“东方橄榄油”。其不饱和脂肪酸约占90％，长期食用可减少低密度脂蛋白的蓄积，有助于降低心血管疾病的风险。山茶油的健康功效不仅与其优质的脂肪酸有关，还与微量活性多酚、维生素e、植物甾醇、角鲨烯密切相关。酚类物质因其广泛的抗氧化活性及抗炎、抗肿瘤、调节血酯等多种生物学活性而广受关注。然而多酚极性较强，目前山茶油主要以压榨制油为主，饼粕中的残油多采用溶剂浸提为主，因而所得山茶油中多酚含量极低，一般低于10mg/kg。目前关于富集保留山茶油中多酚的研究极少。专利201810357004.3公开了通过向山茶油中额外强化添加茶多酚的方法获得富含茶叶多酚的山茶油，含量高达2.2％，然而该多酚非山茶自身来源，而是源自茶叶提取物。专利cn202111351707.3公开了一种同步提取多酚茶油、油茶多肽及油茶多糖的工艺。该工艺以鲜山茶籽为原料，分别经胶体磨粗破碎、胶体磨细碎和均质机均值三步破碎，然后依次采用纤维素酶、蛋白酶水解，最后超声波结合柠檬酸破乳，最终油产率约为35％。一方面，工艺繁琐，多次胶体磨处理造成乳化严重，后期再破乳产率依然不高。此外，柠檬酸破乳可能造成油脂水解、酸价升高，产品易氧化蛤败，进而引起后续精炼炼耗高，产品得率低。水酶法因萃取条件温和、更好地保留油料自身的风味和微量ve、甾醇等活性物质，而越来越受到重视。然而，水酶法油产率低，成本高，且其对极性多酚的溶解有限，因而造成重要的活性物质未能有效萃取。然而关于山茶油绿色高效零乳化制油同时富集多酚的研究还鲜有报道。
技术实现思路
0、(三)
技术实现要素：
1、本发明目的是提供一种生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法，首先将山茶籽粉分散在含蔗糖的异丙醇或乙醇中，采用纤维素酶、蛋白酶水解释放山茶油与添加糖苷酶或果胶酶继续水解同步或分步进行，将水溶液中极性较强的糖基化酚转化为极性减弱的糖基化酚或游离酚，后者疏水性增强进而转移进入山茶油相中；另一方面水相中因多酚转入油相，其与残渣中的多酚平衡被打破，残渣中的多酚进一步溶出。上述过程动态持续进行，不断实现油相中多酚的富集直至达到残渣、水相、油相中多酚的分配平衡。该方法条件温和，不乳化，山茶油产率高(92-95％)，质量好，同时原位富集多酚(多酚含量46.4-95.7ppm)，获得了风味天然、营养增强、安全改善、品质提高的山茶油，该工艺绿色、环保，具有极大应用潜力。
2、本发明采用的技术方案是：
3、本发明提供一种两步生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法，所述方法按如下步骤进行：山茶籽仁粉末加入含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液中，加热灭酶(优选在90℃下搅拌10min进行预处理灭酶)，当温度冷却至50-60℃(优选55℃)时，调节ph至7-9(优选用1m naoh水溶液调节)，加纤维素酶或蛋白酶释放山茶油，混合液在50-60℃水浴中、100-200rpm连续搅拌下水解1-4h；(2)步骤(1)反应液调ph5.0(优选用1m hcl调节)，加入糖苷酶或果胶酶进一步水解富集多酚，混合液在45-55℃水浴、100-300rpm连续搅拌下水解1-4h，灭酶(优选在90℃下搅拌杀菌10min)并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min，收集上清，获得富含多酚的山茶油。
4、进一步，所述异丙醇或乙醇水溶液体积浓度为10-30％，优选20-25％；所述葡萄糖在异丙醇或乙醇水溶液中的浓度为0.1-0.5m，优选0.15m；所述山茶籽仁粉末与含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液质量比为1:5-10，优选1:7；所述山茶籽仁粉末与蛋白酶或纤维素酶质量比为100:0.1-1，优选100:0.7；所述山茶籽仁粉末与糖苷酶或果胶酶质量比为100:0.1-1，优选100:0.7。
5、进一步，步骤(1)水解条件为55℃、150rpm、4h。步骤(2)水解条件为50℃、200rpm、1h。
6、进一步，蛋白酶包括碱性蛋白酶或酸性蛋白酶；所述糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶；所述果胶酶包括酸性果胶酶。
7、进一步，所述步骤(2)糖苷酶或果胶酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或酸性果胶酶中的一种或者α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶等质量的混合。更优选，步骤(1)选择碱性蛋白酶，步骤(2)选择β-葡萄糖苷酶或酸性果胶酶。
8、本发明还提供一种一步生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法，所述方法按如下步骤进行：山茶籽仁粉末加入含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液中，灭酶(优选在90℃下搅拌10min进行预处理灭酶)，当温度冷却至50-60℃(优选55℃)时，调节ph至7-9(用1mnaoh水溶液调节)，加入纤维素酶或蛋白酶，再加入糖苷酶或果胶酶，混合液在45-55℃水浴、100-300rpm连续搅拌下水解1-4h，灭酶(优选在90℃下搅拌杀菌10min)并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min，收集上清，获得富含多酚的山茶油。
9、进一步，所述异丙醇或乙醇水溶液体积浓度为10-30％，异丙醇优选25％；乙醇优选20％；所述葡萄糖在异丙醇或乙醇水溶液中的浓度为0.1-0.5m，优选0.15m；所述山茶籽仁粉末与含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液质量比为1:5-10，优选1:7；所述山茶籽仁粉末与蛋白酶或纤维素酶质量比为100:0.1-1，优选100:0.7；所述山茶籽仁粉末与糖苷酶或果胶酶质量比为100:0.1-1，优选100:0.7。所述蛋白酶包括碱性蛋白酶或酸性蛋白酶；所述糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶；所述果胶酶包括酸性果胶酶。更优选纤维素酶或蛋白酶选择碱性蛋白酶，糖苷酶或果胶酶选择碱性果胶酶或β-葡萄糖苷酶。
10、进一步，水解条件为50℃、200rpm、1h。
11、通常多酚包括强极性的糖基化多酚和极性略弱的游离酚。正常水解结束后，山茶渣子中残留多酚和溶出多酚(溶液中)达到平衡，而溶液部分水相和油相多酚分配平衡。糖苷酶或果胶酶的添加将极性强的糖基化酚转化为疏水性增强的部分糖基化酚和游离酚，而后者可转移进入油相，促进油相多酚的富集。另一方面，水相中结合态酚因酶转化而迁移进入油相引起水相中酚浓度降低，固液中酚平衡打破，酶(糖苷酶)作用下山茶渣中结合态酚释放进入水相。上述过程持续进行直至酚类分配平衡，最终实现油相中酚类明显富集。
12、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
13、本发明以山茶籽仁粉末为原料，提高了山茶籽的利用率，以含葡萄糖或盐的异丙醇或乙醇水溶液为零乳化提取剂，减少了传统有机溶剂提取的溶剂污染问题，同时解决了乳化问题；采用一步法或两步法添加酶，糖苷酶催化的温和转化反应促进了游离多酚向油相转移，有效提高了山茶油中多酚含量。
14、本发明方法采用少量有机溶剂，实现了零乳化，油产率高、多酚富集效果好的目的，同时制油条件温和，山茶油产率高达41.7克油/100g山茶籽，提取率92.5％，且多酚含量近95.72mg/kg，相对于常规水酶法(水作溶剂)制取山茶油乳化严重，清油产率较高为25.8g/100g山茶籽，油提取率为57.22％，本发明方法最大程度地保留了山茶籽的微量营养素(维生素e、甾醇、角鲨烯等)和天然特征风味，尤其富集了高浓度、高活性的多酚功能因子，获得的油脂更营养、更安全、更健康。
1.一种两步生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：山茶籽仁粉末加入含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液中，加热灭酶，当温度冷却至50-60℃时，调节ph至7-9，加纤维素酶或蛋白酶，混合液在50-60℃水浴中、100-200rpm连续搅拌下水解1-4h；(2)步骤(1)反应液调ph5.0，加入糖苷酶或果胶酶，混合液在45-55℃水浴、100-300rpm连续搅拌下水解1-4h，灭酶并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min，收集上清，获得富含多酚的山茶油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异丙醇或乙醇水溶液体积浓度为10-30％，所述葡萄糖在异丙醇或乙醇水溶液中的浓度为0.1-0.5m，所述山茶籽仁粉末与含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液质量比为1:5-10，所述山茶籽仁粉末与蛋白酶或纤维素酶质量比为100:0.1-1，所述山茶籽仁粉末与糖苷酶或果胶酶质量比为100:0.1-1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)水解条件为55℃、150rpm、4h；步骤(2)水解条件为50℃、200rpm、1h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白酶包括碱性蛋白酶或酸性蛋白酶；所述糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶；所述果胶酶包括酸性果胶酶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)糖苷酶或果胶酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或酸性果胶酶中的一种或者α-葡萄糖苷酶与β-葡萄糖苷酶等质量的混合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)选择碱性蛋白酶，步骤(2)选择β-葡萄糖苷酶或酸性果胶酶。
7.一种一步生物法制备山茶油同时原位富集多酚的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：山茶籽仁粉末加入含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液中，灭酶，当温度冷却至50-60℃时，调节ph至7-9，加入纤维素酶或蛋白酶，再加入糖苷酶或果胶酶，混合液在45-55℃水浴、100-300rpm连续搅拌下水解1-4h，灭酶并冷却至室温后，将混合物以8000rpm离心30min，收集上清，获得富含多酚的山茶油。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述异丙醇或乙醇水溶液体积浓度为10-30％，所述葡萄糖在异丙醇或乙醇水溶液中的浓度为0.1-0.5m，所述山茶籽仁粉末与含葡萄糖的异丙醇或乙醇水溶液质量比为1:5-10，所述山茶籽仁粉末与蛋白酶或纤维素酶质量比为100:0.1-1，所述山茶籽仁粉末与糖苷酶或果胶酶质量比为100:0.1-1。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶或酸性蛋白酶；所述糖苷酶包括α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶；所述果胶酶包括酸性果胶酶。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶或蛋白酶选择碱性蛋白酶，所述糖苷酶或果胶酶选择碱性果胶酶或β-葡萄糖苷酶。
