本发明属于医学和生物学，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)核衣壳蛋白特异性单克隆抗体的制备和应用。
背景技术：
1、单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要技术，单克隆抗体在疾病预防、临床治疗、疾病诊断及检测中均有众多应用，同时单克隆抗体在生物学研究领域作为研究工具也得到广泛使用。单克隆抗体具有纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应诸多优越的特点。随着单克隆抗体技术的不断发展与完善，目前在医学、农业、食品、环境等各个领域单克隆抗体都发挥着举足轻重的作用。猪繁殖与呼吸综合征(prrs)又称“猪蓝耳病”，是由prrs病毒(prrsv)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道受损等症状为主要特征的病毒性传染病，分为欧洲种(i型)和美洲种(ii型)。猪繁殖与呼吸综合征在世界范围内广泛存在，给养猪业带来了巨大的经济损失。该病出现的时间短，传播快，发生面广，危害大，目前尚无理想的预防和控制措施，因此加强对该病的监测尤为重要。
2、prrsv是一种有包膜的单股正链rna病毒，属于巢状病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属成员。prrsv病毒粒子呈球形，直径约为50-65nm，核衣壳直径约为30-35nm，内含长约为15.3kb的单股正链基因组rna，在四种动脉炎病毒成员中长度最大。prrsv基因组包含12个开放阅读框(orf):orf1a、orf1a’、tf、orf1b、orf2a、orf2b、orf3、orf4、orf5a和orf5-orf7。其中，orf1a和orf1b编码多蛋白pp1a和pp1b，可加工成17种非结构蛋白(nsp)(nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp2n、nsp2tf、nsp3-14)，在病毒复制中起主要作用。orf5和orf6分别编码主要的gp5和m包膜蛋白，它们相互作用在病毒颗粒表面形成异源二聚体。gp5是prrsv基因组结构蛋白中最易变的区域之一，因此常用于系统发育分析。orf2,orf3和orf4编码次要的gp2a,gp3和gp4蛋白，形成非共价异源二聚体。orf2b和orf5a分别编码两个小的非糖基化蛋白e和gp5a。orf7编码高度保守的核衣壳蛋白(n蛋白)。
3、prrsv n蛋白具有123或128个氨基酸(aa)残基(分别适用于北美和欧洲毒株)，蛋白分子量约为14-15kd。n蛋白在感染细胞中大量表达，约占病毒粒子蛋白质含量的20-40％，具有极强的免疫原性。在病毒粒子内，n蛋白主要以二硫键形成的同源二聚体形式存在，然后多聚化形成电子显微镜下可见的二十面体核心结构。因为n蛋白是免疫原性极强的结构蛋白，因此猪感染prrsv后或者接种prrsv疫苗后，血清中针对n蛋白的特异性抗体最早出现，抗体水平最高并且持续时间也最长。n蛋白诱导的高水平特异性抗体虽然无中和抗原的作用，但鉴于其极强的免疫原性，使得n蛋白仍然是最适用于prrs诊断抗原的靶蛋白之一。
4、对prrsv单克隆抗体的研究可为prrsv快速检测方法的建立提供材料，是prrs研究中的热点之一。鉴于目前prrsv-ii和pssrv-i内都有众多谱系/基因型的毒株，不同谱系/基因型prrsv的n蛋白序列有较大差异，缺少通用的prrsv检测方法。
技术实现思路
1、本发明针对所要解决的技术问题，为了补充prrs的检测诊断方法而提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白抗原表位肽及其特异性单克隆抗体的制备和应用。
2、本发明的目的之一在于，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白抗原表位肽，该抗原表位肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白52～55或/和109～113肽段，其氨基酸序列为52kphf55或/和109hhtvr113。
3、本发明的目的之二在于，提供上述的抗原表位肽在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性抗体中的应用。
4、本发明的目的之三在于，提供猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体，该单克隆抗体能够识别的猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白上高度保守的抗原表位为52～55aa和部分保守的抗原表位为109～113aa。
5、本发明基于所有prrsv毒株中高度保守的n蛋白的单抗识别抗原表位，建立通用的prrsv检测方法。
6、上述猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体，其重链可变区核苷酸序列如seq id no.1所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.3所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。
7、一种猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的制备，包括以下步骤：
8、(1)将prrsv n基因与中间表达载体penter4-mcs-2ha连接获得重组表达质粒penter4-n-2ha；
9、(2)将penter4-n-2ha与目的表达载体pdest527进行位点特异lr重组反应，获得重组表达质粒pdest527-n-2ha；
10、(3)将pdest527-n-2ha转化到de3/bl21感受态大肠杆菌，诱导表达，获得prrsv n蛋白；
11、(4)采用prrsv n蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤sp2/0细胞进行融合，获得杂交瘤细胞；(5)杂交瘤细胞进行亚克隆后，腹腔注射，得到猪呼吸与繁殖综合征病毒n蛋白的特异性单克隆抗体。
12、上述位点特异lr重组是指将载体penter4-n-2ha的attl位点与载体pdest527的attr位点进行精确重组。本发明使用细胞融合杂交瘤技术制备prrsv n蛋白特异性单克隆抗体，将获得的prrsv n蛋白单克隆抗体成功用于各种免疫学检测试验，并基于制备的单克隆抗体建立优化了双抗夹心elisa检测prrsv抗原的方法，可用于后续商品化试剂盒的开发。
13、本发明的目的之四在于，提供上述猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
14、上述应用，包括elisa检测、wb检测、ifa检测。
15、最后，本发明还提供了所述的抗原表位肽、单克隆抗体在诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
16、上述的应用，包括以下任一种或多种：
17、(1)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中应用；
18、(2)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中应用；
19、(3)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的试剂中的应用。
20、本发明基于识别上述抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的双抗夹心elisa检测方法。
21、本发明开发出的针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)核衣壳蛋白n特异单克隆抗体是prrsv研究的特定有用工具，能够成功地应用于各种免疫学试验，包括酶联免疫吸附试验(elisa)、蛋白质印迹(wb)与免疫荧光(ifa)实验，可以应用于prrsv的功能研究。同时，建立了检测通用prrsv抗原的双抗体夹心elisa方法，对prrsv防控发挥重要的作用。
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白52～55或/和109～113肽段，其氨基酸序列为52kphf55或/和109hhtvr113。
2.如权利要求1所述的抗原表位肽在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性抗体中的应用。
3.猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够识别的猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白上高度保守的抗原表位为52～55aa和部分保守的抗原表位为109～113aa。
4.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如seq id no.1所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.3所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。
5.猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的制备，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括elisa检测、wb检测、ifa检测。
8.如权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求3所述的单克隆抗体在诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一种或多种：
10.基于识别权利要求1所述抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的双抗夹心elisa检测方法。
