本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种表达新型鸭呼肠孤病毒σb、σc蛋白的重组杆状病毒灭疫苗及其制备方法及应用。
背景技术：
0、技术背景
1、新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus, ndrv）病是一种以肝脏、脾脏发生肿大、出血、坏死为主要特征的鸭病毒性传染病。该病无明显发病周期，可通过水平、垂直方式传播，鸭感染后会导致严重的发育障碍和免疫抑制从而引起多种并发症，导致雏鸭死亡，对水禽养殖业造成极大危害。此外，ndrv感染的宿主范围正在不断扩大，目前所有种类的雏鸭和雏鹅都可感染，严重阻碍了水禽养殖业的健康发展。
2、目前尚无新型鸭呼肠孤病毒ndrv商品化疫苗。
3、传统的疫苗制备方法，如弱毒活疫苗和灭活疫苗，存在各自的局限性。弱毒活疫苗生产成本较低，可大规模接种，且能诱导多种免疫反应，然而其制备过程中病毒致弱周期长、存在随机性，还有毒力返强的风险，同时需要冷链进行储存和运输。相比之下，灭活疫苗安全性更高，但免疫原性较低，抗体应答起效慢，且成本较高。而且，这两种疫苗的生产都高度依赖鸡胚，其质量和安全性受到鸡胚质量和来源的影响，还存在成本高、生物废弃物多、内源病毒污染风险等问题。
4、与传统的灭活疫苗和弱毒活疫苗相比，亚单位疫苗安全性高、稳定性强。当前，昆虫细胞-杆状病毒表达系统已成为研制亚单位疫苗的常用技术平台。其具有多种优势，如，只感染节肢动物、对脊椎动物安全、基因组大能容纳外源基因插入、蛋白表达水平高、表达的蛋白具有天然生物学活性以及生产成本低等。
5、ndrv的σb蛋白是病毒的主要外衣壳蛋白，它携带有群特异型中和抗原决定簇；ndrv的σc蛋白是病毒的外衣壳蛋白，能够介导病毒与宿主细胞的吸附和细胞融合过程。因此，σb、σc蛋白是ndrv基因工程疫苗研发的主要靶标。
技术实现思路
1、为了多条技术路线储备ndrv疫苗，同时也为了改进传统灭活疫苗制备技术存在的缺点与不足，本发明的目的是提供能够表达ndrv σb、σc蛋白的重组杆状病毒， 基于重组杆状病毒制备的灭活苗能够激发雏鸭的有效的抗体应答，并提供高效的保护。
2、本发明的另一目的在于提供上述表达ndrv σb、σc蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法。
3、本发明的第三个目的在于提供上述表达ndrv σb、σ蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗的应用。
4、本发明目的通过下述技术方案实现：一种表达ndrv σb、σc蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗，重组杆状病毒rbac-σb表达的新型鸭呼肠孤病毒ndrv σb蛋白和重组杆状病毒rbac-σc表达的新型鸭呼肠孤病毒ndrv σc蛋白；σb蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq idno：1所示；σc蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
5、在一些实施例中，所述重组杆状病毒rbac-σb、重组杆状病毒rbac-σc的制备方法包括：
6、将seq id no：1的基因克隆到杆状病毒转移载体中，获得包含ndrv σb基因的重组转移载体；将包含ndrv σb基因的重组转移载体与杆状病毒的线性基因组dna共转染宿主细胞，得到重组杆状病毒rbac-σb；
7、将seq id no：2的基因克隆到杆状病毒转移载体中，获得包含ndrv σc基因的重组转移载体；将包含ndrv σc基因的重组转移载体与线性化的杆状病毒的基因组dna共转染宿主细胞，将包含ndrv σc基因的重组转移载体与杆状病毒的线性基因组dna共转染宿主细胞，得到重组杆状病毒rbac-σc。
8、进一步地，所述杆状病毒转移载体为pvl1393载体。在该实施例中，包含ndrv σb基因的重组转移载命名为pvl1393-σb，包含ndrv σc基因的重组转移载体命名为pvl1393-σc。
9、进一步地，所述的杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒acmnpv。
10、进一步地，所述宿主细胞为sf9细胞。
11、在一些实施例中，所述重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法包括：
12、将重组杆状病毒rbac-σb、重组杆状病毒rbac-σc分别接种宿主细胞进行增殖，表达新型鸭呼肠孤病毒ndrv σb和σc蛋白，灭活病毒获得σb抗原、σc抗原；
13、将σb抗原、σc抗原与佐剂混合、乳化，得到所述重组杆状病毒灭活疫苗。
14、进一步地，所述佐剂为seppic佐剂。
15、进一步地，σb抗原、σc抗原与佐剂按照质量比0.5：0.5：2的比例混合。
16、在一些实施例中，表达新型鸭呼肠孤病毒σb、σc蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
17、 (1)重组杆状病毒rbac-σb和rbac-σc的制备：
18、利用生物信息学方法获得了ndrv σb、σc的共识序列，该序列与已公布的大多数序列ndrv σb、σc具有较高的同源性，通过基因合成σb、σc基因，所得的序列如seq id no：1，seq id no：2所示，然后将σb、σc基因克隆到杆状病毒转移载体pvl1393载体中，构建包含ndrv σb、σc基因的重组转移载体，基于同源重组的原理，将重组转移载体与苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒acmnpv的线性基因组dna共转染至昆虫细胞sf9，成功拯救重组杆状病毒rbac-σb和rbac-σc。
19、(2)灭活重组杆状病毒制备：
20、首先进行重组杆状病毒的遗传稳定性的鉴定，将重组病毒rbac-σb和rbac-σc在sf9悬浮细胞中连续传代，检测每代重组病毒基因组内的σb、σc基因；选择病毒滴度最高的一代作为抗原制备种毒，运用bei的方法灭活病毒制备抗原；将彻底灭活的抗原配合seppic佐剂乳化制成重组杆状病毒灭活疫苗。
21、优选地，步骤(2)所述的运用bei的方法灭活病毒制备抗原，具体是：将工作浓度为170mm/l的bei与抗原液按照体积比为1：17的比例混匀，置于37℃培养摇床，120rpm轻摇48h后终止灭活。
22、本发明中，所述重组杆状病毒推荐传代5次，选择传代目的有两个：①比较每代病毒滴度，选择病毒滴度最高的一代作为抗原制备种毒；②验证重组杆状病毒的稳定性为后期疫苗的制备提供保障。
23、上述表达ndrv σb、σc蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗的应用，应用于鸭呼肠孤病毒疫苗的制备。
24、本发明基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统安全性好、蛋白表达量高、易于大规模生产等独特优势，利用杆状病毒转移载体pvl1393提供的ph启动子和多克隆位点，选择ndrv σb、σc共识蛋白作为疫苗设计的靶蛋白，构建了含有σb、σc基因的重组转移载体pvl1393-σb、pvl1393-σc。并且杆状病毒转移载体pvl1393含有与杆状病毒基因组序列同源的重组序列，在共转染时，这些序列与线性失活的杆状病毒dna进行同源重组获得环化复活的重组杆状病毒rbac-σb和rbac-σc，对病毒的生长特性、遗传稳定性、外源蛋白表达等生物学特性进行鉴定，并优化了重组杆状病毒灭活的各项条件，制备了重组杆状病毒灭活疫苗，评价了其在麻鸭中的免疫原性与保护效力。以上内容不仅为研制鸭呼肠孤病毒疫苗提供了新思路，而且该疫苗在鸭呼肠孤病毒的防控上具有较好的应用前景，且符合兽用疫苗利用悬浮细胞培养技术进行大规模生产的趋势。
25、本发明有益效果：
26、（1）现有疫苗仅能覆盖少部分毒株，且难以应对可能发生的病毒变异与重组；本发明利用生物信息学方法获得了ndrv σb、σc的共识序列，该序列与已公布的大多数序列ndrvσb、σc具有较高的同源性，具有覆盖大部分毒株的潜力；（2）传统活疫苗与灭活疫苗均高度依赖鸡胚，存在生产成本较高、内源病毒污染、生物废弃物产量大等缺陷。目前，处于临床前研究阶段的 ndrv 的疫苗主要包括病毒载体苗、亚单位苗、dna疫苗。其中，亚单位苗具有成本低、抗原表达量高、免疫原性较强等优势，是替代传统鸡胚化疫苗的最具潜力的疫苗类型。本发明基于昆虫杆状病毒表达系统分别表达了ndrv的σb、σc蛋白，研制出了免疫原性强的ndrv亚单位疫苗，为ndrv疫苗的升级换代与疫病防控提供了新的技术手段。基于重组杆状病毒的灭活疫苗能够在雏鸭中诱导快速的抗体应答，具有较强的免疫原性；疫苗显著降低麻鸭肝脏、脾脏的病毒载量、降低病毒排毒、减轻病毒对肝脏和脾脏的损伤，且rbac-σc组、rbac-σb+σc组的免疫效果优于rbac-σb组、灭活疫苗组；其中以rbac-σb+σc组效果最佳。
1.一种重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，包括：重组杆状病毒rbac-σb表达的新型鸭呼肠孤病毒ndrv σb蛋白和重组杆状病毒rbac-σc表达的新型鸭呼肠孤病毒ndrv σc蛋白。
2.权利要求1所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述σb蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述σc蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.权利要求1所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法包括：
4.权利要求3所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为seppic佐剂。
5.权利要求3所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，σb抗原、σc抗原与佐剂按照质量比0.5：0.5：2的比例混合。
6.权利要求1至5任一项所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述重组杆状病毒rbac-σb、重组杆状病毒rbac-σc的制备方法包括：
7.权利要求6所述的重组杆状病毒灭活疫苗，其特征在于，满足以下至少一项：
8.一种抗原，其特征在于，所述抗原采用权利要求6所述的重组杆状病毒rbac-σb、重组杆状病毒rbac-σc制备得到。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8所述的抗原。
10.权利要求6所述的重组杆状病毒rbac-σb、重组杆状病毒rbac-σc在制备ndrv亚单位疫苗中的应用。
