本发明涉及基因检测，具体涉及一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合、试剂盒及系统。
背景技术：
1、宫颈癌，也称为子宫颈癌，是发生在子宫颈部位的恶性肿瘤，是女'性生殖道最常见的妇科恶性肿瘤。人乳头状瘤病毒(hpv)是该病发生的最主要危险因素。可以通过定期筛查和注射疫苗预防宫颈癌。早期宫颈癌治愈率高，预后相对好。
2、宫颈癌的发生过程是由正常宫颈细胞感染高危型hpv病毒，然后从cin1到cin2到cin3，最后进展为宫颈浸润癌。在这个过程中，cin2后期和cin3，特定基因甲基化异常升高，因此，通过检测特定基因甲基化的异常变化，可以评估宫颈病变的进展风险。通过特定基因甲基化检测转化性病变(部分cin2与cin3)时，可知道癌症进展的风险，提示医生是否立即进行治疗介入或是保持观察追踪。
3、dna甲基化是一种重要的表观修饰，它在不改变dna序列的情况下，对基因表达模式以及基因组的稳定性起重要的调控作用。人类抑癌基因启动子的高甲基化，在包括宫颈癌在内的许多肿瘤的发生、发展的各阶段均有其特异性的改变模式。多数研究显示宿主基因甲基化水平随宫颈病变严重程度的增加而升高，可以作为宫颈癌及癌前病变筛查的生物学标志物。常见的应用于甲基化研究的方法有：甲基化特异性pcr (methylation-specificpcr，msp)、亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing pcr，bsp) 和高分辨率熔解曲线法(high resolution melting，hrm)等。每种方法都有各自的特点，bsp法结果准确性较高，易于直观进行判读，但灵敏度较低，操作相对更为繁琐成本高；hrm法灵敏度相对较低，同时结果分析略复杂；pcr法检测灵敏度高，对样本的要求相对较低，同时检测时长较短、成本较低，结果易于判读。
4、目前常用的宫颈癌筛查方式有宫颈细胞检测和hpv核酸检测。宫颈细胞检测属于细胞学的筛查，需要严格的操作环境，没有普遍性，并且细胞学筛查的敏感性极低，结果可靠性差；hpv核酸检测虽然具有较高的敏感性和较强的特异性，但实验室处理需求与成本均较高，结果获取周期较长。因此目前亟需一种方便快捷、灵敏度高、特异性强的宫颈癌病变风险筛查方式。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合、试剂盒及系统，以解决目前针对宫颈癌病变风险评估成本高、周期长或可靠性较低的问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合，包括zscan1基因、pou4f3基因、sox1基因和jam3基因。
4、进一步，所述zscan1基因的基因片段为hg19 : chr19: 58545016-58545118，所述pou4f3基因的基因片段为hg19 :chr5:145719056-145719165，所述sox1基因的基因片段为hg19 :chr13:112722854-112722960，所述jam3基因的基因片段为hg19 :chr11:133938142-133938213。
5、第二方面，本发明提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的引物组探针组，包括特异性引物和特异性taqman探针；
6、所述特异性引物包括：
7、zscan1-f: ggttgcgtgtttggaatgtc，
8、zscan1-r: gcaacgtcaaaaacgctactac；
9、pou4f3-f: agagtttgttggtacgcgtc，
10、pou4f3-r: acgaaataaacgtacaaaacacg；
11、sox1-f: ggagttgggtttttattgcgttc，
12、sox1-r: cgaactcgccctcctc；
13、jam3-f: cgaggatagcggttttggtttc，
14、jam3-r: cccaaccctaactacgaaaacg；
15、所述特异性taqman探针包括：
16、zscan1-p: tcgcggttttatcgtatatgcg；
17、pou4f3-p: ttggcggcggtggatatcgtt；
18、sox1-p: atcgttaattattcggaacgcgcg；
19、jam3-p: ttcggggtttcgggtcgga。
20、进一步，还包括内参基因的特异性引物和特异性taqman探针；所述内参基因的特异性引物和特异性taqman探针包括：
21、actb-f: tttgagatgtatgaaggtttttggt，
22、actb-r: acacttttattcaactaatctcaaatcaa；
23、actb-p: tgggtggaggtagttagggttt。
24、第三方面，本发明提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的扩增体系，包括第一扩增体系和第二扩增体系，所述第一扩增体系包括zscan1基因的特异性引物和特异性taqman探针、jam3基因的特异性引物和特异性taqman探针和内参基因的特异性引物和特异性taqman探针；所述第二扩增体系包括pou4f3基因的特异性引物和特异性taqman探针、sox1基因的特异性引物和特异性taqman探针和内参基因的特异性引物和特异性taqman探针。
25、进一步，zscan1基因的特异性taqman探针用5`6-fam、3`mgb方式进行标记；jam3基因的特异性taqman探针用5`6-vic、3`bhq1方式进行标记；pou4f3基因的特异性taqman探针用5`6-fam、3`bhq1的方式进行标记；sox1基因的特异性taqman探针用5`6-vic、3`bhq1的方式进行标记；内参基因的特异性taqman探针用5`cy5、3`bhq3的方式进行标记。
26、第四方面，本发明提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的试剂盒，包括所述的引物组探针组或所述的扩增体系。
27、第五方面，本发明提供一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的系统，包括采集转化模块、扩增反应模块、数据读取模块和分析模块；
28、所述采集转化模块，用于采集宫颈拭子细胞并进行dna提取，并将提取的dna进行亚硫酸氢盐转化，得bis-dna；
29、所述扩增反应模块，用于采用权利要求5或6所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的扩增体系对bis-dna进行三重qpcr扩增；
30、所述数据读取模块，用于读取相应通道的ct值，并用相应通道的ct值减去其中内参基因的ct值，得到对应基因的δct值；
31、所述分析模块，用于根据zscan1基因、pou4f3基因、sox1基因和jam3基因的δct值与其δct阈值比较，当各基因的δct值小于等于其δct阈值时，对其赋采用逻辑回归计算的对应基因的评分，反之则为0分，将各基因的评分求和，与以cin2为临床诊断界值并依据约登指数最大原则确定的最佳阈值比较，其和小于等于该最佳阈值判定为阳性或有病变风险，反之判定为阴性或没有病变风险。
32、进一步，所述系统采用siha细胞株的gdna作为阳性对照样本，采用hek293细胞株的gdna作为阴性对照样本。
33、进一步，所述数据读取模块中将cy5标记的扩增产物阈值设置为0.1，fam-mgb标记的扩增产物阈值设置为0.15，fam-none标记的扩增产物阈值设置为0.2，fam- none标记的扩增产物阈值设置为0.05，采用roc曲线法确认每个基因的δct 阈值，其中pou4f3的δct阈值为9.85，sox1的δct阈值为13.05，zscan1的δct阈值为6.85，jam3的δct阈值为18.5；所述分析模块中采用逻辑回归计算基因的评分，其中pou4f3的评分为0.6637，sox1的评分为0.5744，zscan1的评分为1.063，jam3的评分为0.3572，当各基因的δct小于等于其δct阈值时，对其赋对应基因的评分，反之则为0分，最后将各基因的得分相加，得最终得分，当最终得分小于等于最佳阈值时则该样本为阳性或有病变风险，反之则为阴性或没有病变风险。
34、本发明的有益效果在于：本发明针对评估宫颈病变风险的标志物进行筛选，并对合适的引物和探针进行设计，进一步确定标志物片段，并进行三重qpcr扩增对亚硫酸氢盐转化的dna样本进行检测，并寻找合适的阴阳性样本进行比对，根据病理结果以cin2为临床诊断界值并依据约登指数最大原则确定阈值，进行结果评估。采集宫颈脱落细胞的分泌物都是必要的操作。而其剩余的细胞保存液，即可应用于本发明做甲基化的情况研究，在样本来源上，不会给患者带来额外的不便。cin2+的灵敏性为89%，特异性为100%；cin3+的灵敏性为93.55%，特异性为93.02%，达到对宫颈高级别病变及宫颈癌更精确的检测。
1.一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合，其特征在于，包括zscan1基因、pou4f3基因、sox1基因和jam3基因。
2.根据权利要求1所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合，其特征在于，所述zscan1基因的基因片段为hg19 : chr19: 58545016-58545118，所述pou4f3基因的基因片段为hg19 :chr5:145719056-145719165，所述sox1基因的基因片段为hg19 :chr13:112722854-112722960，所述jam3基因的基因片段为hg19 :chr11:133938142-133938213。
3.一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的引物组探针组，其特征在于，包括特异性引物和特异性taqman探针；
4.根据权利要求3所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的引物组探针组，其特征在于，还包括内参基因的特异性引物和特异性taqman探针；所述内参基因的特异性引物和特异性taqman探针包括：
5.一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的扩增体系，其特征在于，包括第一扩增体系和第二扩增体系，所述第一扩增体系包括zscan1基因的特异性引物和特异性taqman探针、jam3基因的特异性引物和特异性taqman探针和内参基因的特异性引物和特异性taqman探针；所述第二扩增体系包括pou4f3基因的特异性引物和特异性taqman探针、sox1基因的特异性引物和特异性taqman探针和内参基因的特异性引物和特异性taqman探针。
6.根据权利要求5所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的扩增体系，其特征在于，zscan1基因的特异性taqman探针用5`6-fam、3`mgb方式进行标记；jam3基因的特异性taqman探针用5`6-vic、3`bhq1方式进行标记；pou4f3基因的特异性taqman探针用5`6-fam、3`bhq1的方式进行标记；sox1基因的特异性taqman探针用5`6-vic、3`bhq1的方式进行标记；内参基因的特异性taqman探针用5`cy5、3`bhq3的方式进行标记。
7.一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4所述的引物组探针组或权利要求5或6所述的扩增体系。
8.一种用于基因甲基化评估宫颈病变风险的系统，其特征在于，包括采集转化模块、扩增反应模块、数据读取模块和分析模块；
9.根据权利要求8所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的系统，其特征在于，所述系统采用siha细胞株的gdna作为阳性对照样本，采用hek293细胞株的gdna作为阴性对照样本。
10.根据权利要求8所述的用于基因甲基化评估宫颈病变风险的系统，其特征在于，所述数据读取模块中将cy5标记的扩增产物阈值设置为0.1，fam-mgb标记的扩增产物阈值设置为0.15，fam-none标记的扩增产物阈值设置为0.2，fam- none标记的扩增产物阈值设置为0.05，采用roc曲线法确认每个基因的δct 阈值，其中pou4f3的δct阈值为9.85，sox1的δct阈值为13.05，zscan1的δct阈值为6.85，jam3的δct阈值为18.5；所述分析模块中采用逻辑回归计算基因的评分，其中pou4f3的评分为0.6637，sox1的评分为0.5744，zscan1的评分为1.063，jam3的评分为0.3572，当各基因的δct小于等于其δct阈值时，对其赋对应基因的评分，反之则为0分，最后将各基因的得分相加，得最终得分，当最终得分小于等于最佳阈值时则该样本为阳性或有病变风险，反之则为阴性或没有病变风险。
