本发明涉及罗汉果提取物制备，特别涉及一种罗汉果甜苷v的工业制备方法。
背景技术：
1、罗汉果，别名拉江果、假苦瓜，植物学名“光果木鳖”，是一年种多年收的葫芦科植物罗汉果的果实。罗汉果为中国特有的经济、药用植物，有300多年的应用历史，分布于广西、湖南、广东、海南、贵州等热点、亚热带山区，由于对树脂环境条件的特殊要求，其主产区分布在广西桂林永福县、临桂县和融安县。自1977年版《中国药典》起作为常用中药收载，具有清热润肺，滑肠通便的功效，主治肺热或肺燥咳嗽，百日咳，痰火咳嗽，血燥便秘等症；此外罗汉果还是一种极好的清凉饮料，既可提神生津，又可预防呼吸道感染，常年服用，能延年益寿，被誉为“东方神果”和“长寿之果”；1987年罗汉果被国家卫生部列为药食同源品种。
2、罗汉果甜苷是罗汉果独有的，研究最多的化学成分，其中又以罗汉果甜苷v含量最高，其甜度是蔗糖的300倍左右，且热量接近于0，是罗汉果的主要甜味物质，是一种优良的天然甜味剂，现在不同含量的罗汉果甜苷产品目前已经实现了规模化生产，且主要是以甜苷v的含量为衡量标准。
3、cn107602653a公开了一种从鲜罗汉果中提取罗汉果甜苷的方法，具体为压榨、离心、大孔吸附树脂吸附、75-85％乙醇一次解吸、脱色、浓缩、干燥即得纯度约90％的罗汉果甜苷。该工艺制备方法相对简便，但是制得的罗汉果甜苷含量只有约90％。
4、cn115109112a公开了一种提高罗汉果甜苷v含量的罗汉果甜苷工业生产方法，具体为破碎、水提、过滤澄清、第一大孔吸附树脂吸附、阴离子交换树脂吸附、第二大孔吸附树脂吸附、浓缩、喷雾干燥，该工艺极其复杂，先后经过三次层析，累计多达近11次的上柱、洗柱及解吸，所得的罗汉果甜苷的含量也仅仅只有52-60％，工业化投入产出不匹配。
5、cn111333691a公开了一种罗汉果甜苷v的制备方法，具体为鲜果干燥、制备浸膏、活性炭脱色、大孔吸附树脂吸附、三梯度洗脱、超滤、聚酰胺层析吸附、三梯度洗脱、喷雾干燥。该方法在大孔吸附树脂吸附和聚酰胺层析吸附后，分别采用了三个浓度的乙醇水溶液进行洗脱，工序较为繁琐。
6、cn113943337a公开了一种从罗汉果中提取高浓度罗汉果甜苷v的方法，具体为筛选、冷冻、破碎、浸提、聚酰胺树脂吸附、洗脱、过阴阳离子交换树脂、超滤、浓缩干燥即得。该方法在解吸时其醇水浓度较低，导致解吸不完全，产品收率偏低，总收率约92％，最高含量约为85％。
7、cn1706861a公开了一种高纯度罗汉果甜苷v的制备方法和用途，具体为粉碎、大孔吸附树脂吸附、两梯度解吸、正向硅胶分离、反向硅胶分离、浓缩干燥即得，该工艺涉及到三次层析，且大孔吸附树脂层析需要两梯度解吸。
8、cn112574271a公开了一种用大孔吸附树脂纯化罗汉果甜苷v的方法，具体为上柱、水洗柱、20％乙醇洗脱、40％乙醇洗脱、60％乙醇洗脱、浓缩干燥，得到70-80％的罗汉果甜苷v产品。该工艺需要针对层析柱进行三个梯度解吸。
9、cn113603742a公开了一种罗汉果甜苷v的制备方法，具体为浸提、大孔吸附树脂吸附、酸水除杂、中性水洗柱、0-65％醇水线性解吸、浓缩干燥、渗漏浸提、膜过滤、浓缩干燥后即得最高为92％的产品。该工艺涉及到亚临界状态，对设备及操作技术要求高。
10、上述公开的专利中对罗汉果甜苷v的提取纯化方法基本上都涉及到将罗汉果进行水和/或醇进行浸提、然后固液分离、膜过滤、大孔树脂进行吸附、解吸、离子交换树脂或活性炭脱色、浓缩干燥后，即得高含量产品，其树脂层析是提高产品含量的关键性步骤。上述公开的专利为了获得高含量的罗汉果甜苷v产品，基本上在每次大孔吸附树脂层析后，都进行了两次、甚至三次的不同梯度浓度醇水溶液解吸，且在解吸时都需要使用高体积分数的醇水溶液；如果仅用一个梯度的醇水溶液进行解吸，则获得罗汉果甜苷v产品含量普遍偏低；同时其中有部分技术为了提高含量使用了极为繁琐的工艺步骤，使其产业化应用难度较大。
技术实现思路
1、本发明在现有的传统罗汉果苷v制备工艺之上进行改进与升级，从减少大孔吸附树脂层析次数、降低解吸醇水体积分数及调整洗柱液组分的角度入手，采用氢氧化钙过饱和醇水溶液的变温解吸技术，制得高含量高收率罗汉果甜苷v产品。该技术只需在传统层析柱外壁加装保温夹层即可，同时不需要体积分数过高的醇水溶液，且设备要求低、工艺简单、对环境友好、实用性广，适用于规模化生产。
2、本发明通过以下技术方案实现上述目的：
3、一种罗汉果甜苷v的工业制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将罗汉果浸提、固液分离后絮凝，过超滤膜，收集透过液；
5、(2)透过液上柱于大孔吸附树脂；
6、(3)一次洗柱与解吸：用碱水洗柱后，过饱和氢氧化钙醇水溶液进行0-5℃至60-70℃的线性变温解吸，分段收集解吸液，低温段收集得到解吸液i，高温段收集得到解吸液ⅱ，解析液i中罗汉果甜苷v的含量低于解吸液ⅱ；
7、(4)二次层析吸附：将解吸液i用水稀释后，用酸调节ph值，上柱于大孔吸附树脂；
8、(5)二次洗柱与解吸：大孔吸附树脂依次经过热纯水洗柱、热碱水洗柱、热纯水洗柱至接近中性，用热酸性醇水溶液解吸得到解吸液ⅲ；
9、(6)浓缩除醇：分别将收集的解吸液ⅱ和解吸液ⅲ合并，进行浓缩，除去醇味，得到浓缩液；
10、(7)膜过滤：将浓缩液用纯水稀释并过陶瓷膜；得到透过液。
11、(8)脱色脱盐：将步骤(7)透过液依次过阴离子交换树脂和阳离子交换树脂层析柱，收集得到流出液。
12、(9)浓缩干燥：将步骤(8)流出液进行浓缩、干燥后，即得高含量的罗汉果甜苷v产品。
13、优选地，步骤(1)中，所述罗汉果为罗汉果鲜果或干果，鲜果罗汉果甜苷v的含量不低于0.36％；所述浸提为以水为浸提溶媒，通过罐式提取或者连续逆流提取方式提取；所述浸提罗汉果鲜果与水的料水质量比为1:2～5。
14、优选地，步骤(1)中，所述浸提温度为80～100℃；浸提时间为2～4h。
15、步骤(1)中，所述固液分离是以实现罗汉果渣与提取液的分离为目的，包括卧螺离心、碟式离心中的任意一种或组合；所述絮凝为向固液分离后的清液中加入1～7％的絮凝剂，所述絮凝剂为有机高分子物质壳聚糖或聚丙烯酰胺中的任意一种；搅拌均匀絮凝后，再次固液分离，实现罗汉果渣与提取液的分离为目的，包括卧螺离心、碟式离心中的任意一种或组合。
16、优选地，步骤(1)中，所述超滤膜是截留分子量为5000～20000da，更优选8000～15000da。
17、优选地，步骤(2)中，大孔吸附树脂体积与原料中甜苷v总质量比为40～100:1(ml/g)，径高比为1:3～8，上柱流速为0.5～1.0bv/h；所述的大孔吸附树脂的型号为d101、ab-8、lx-t28、lx-t5、lxd-762、lx-94中的任意一种。
18、步骤(2)中，上柱前需要进行脱气处理；所述的脱气方法为抽真空处理或者超声波处理。所述的抽真空处理为保持真空度为-0.1mpa至-0.05mpa，保持20～30min；所述的超声波处理为30～50khz、100～300w，保持5～10min。
19、步骤(3)中，碱水为2-5wt％的氢氧化钠和/或者氢氧化钾水溶液，碱水洗柱的流速为1.5～2.5bv/h，碱水洗柱体积为1.5～2bv。大孔吸附树脂吸附了罗汉果甜苷v的同时，也吸附了大量的杂质，碱性溶液洗柱时，其可以改变部分杂质的极性进而使其脱离大孔吸附树脂基团表面，使其随洗柱的碱水被洗脱下来。
20、优选地，步骤(3)中，所述过饱和氢氧化钙醇水溶液中氢氧化钙浓度为0.2-0.25wt％，有少量不溶解的为正常现象，是由于体系为过饱和状态。过饱和氢氧化钙醇水溶液在上柱前过陶瓷膜。过滤过饱和氢氧化钙醇水溶液中的不溶部分氢氧化钙，以防止流入层析柱，导致层析柱堵塞。
21、所述的过饱和氢氧化钙醇水溶液，是在醇体积分数为40-50％醇水溶剂体系中进行配制得到，醇优选为乙醇。
22、优选地，步骤(3)中，所述的线性解吸方式为柱温和解吸液的温度由0-5℃线性升高至60-70℃，升温速率为5～10℃/bv，流速为1.5～2.5bv/h。
23、优选地，步骤(3)中，所述的收集为分段收集，低温段收集得到罗汉果甜苷v含量较低的解吸液i，随着温度升高，解析液中罗汉果甜苷v的含量逐渐升高，且杂质含量降低，收集得到解吸液ii。
24、优选地，监控解吸液中罗汉果甜苷v的含量，以干重计，甜苷v含量≥90％停止收集解吸液i，开始收集解吸液ii。优选甜苷v含量≥93％开始收集解吸液ii，更优选甜苷v含量≥95％开始收集解吸液ii。
25、氢氧化钙其溶解度随着温度的升高而降低，进而导致其ph值也随着温度的升高而降低进而影响其水溶液的极性；水的温度与极性也成相关性，温度升高，水的极性也会降低。本发明人发现，选择过饱和氢氧化钙醇水溶液作为洗脱剂，其温度由0-5℃线性升高至60-70℃的过程中，洗脱剂ph值在逐渐升高，极性在逐渐降低。即在洗脱前期，洗脱剂ph值较高，极性较大，对罗汉果甜苷v具有较小的洗脱能力，而对杂质有较大的洗脱能力。采用线性洗脱方式，可以在前期较低的温度条件下有效保留罗汉果甜苷v并且除去杂质，在后期较高温度条件下，有效的将层析柱上的罗汉果甜苷v充分洗脱下来，并且杂质含量低。同时，在较高温度条件下，水的极性会减弱，进而降低了整个洗脱剂体系的极性，可以实现在确保获得较低极性的洗脱剂前提下，不需要过高的乙醇体积分数，从而减低的乙醇使用量和其浓度。
26、优选地，步骤(4)中，稀释倍数为4～8倍；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸中的任意一种；所述ph值为1～4。
27、本发明人发现，将含有较低含量罗汉果甜苷v的解吸液i直接用纯水稀释后调节为酸性，其溶液体系为低体积分数的酸性乙醇水溶液，改变了上柱液的酸碱性，将其直接作为上柱液，可以在确保罗汉果甜苷v完全被树脂吸附的同时，也能有效的确保大量的杂质不被树脂吸附，大大提高了树脂的特异性吸附和洗脱效果。
28、优选地，步骤(4)中，大孔吸附树脂体积与上柱液中甜苷v总质量比为40～80:1(ml/g)；所述的大孔吸附树脂的型号为d101、ab-8、lx-t28、lx-t5、lxd-762、lx-94中的任意一种；层析柱径高比为1:3～8，上柱流速为0.5～1.0bv/h
29、步骤(4)中，所述的上柱液在上柱前需要进行脱气处理；所述的脱气方法为抽真空处理或者超声波处理。所述的抽真空处理为保持真空度为-0.1mpa～-0.05mpa，保持20～30min；所述的超声波处理为30～50khz、100～300w，保持5～10min。
30、优选地，步骤(4)中，所述的大孔吸附树脂型号为与步骤(2)中不同型号的任意一种树脂。两次前后依次过柱(两个相同型号树脂，或者两个不同型号树脂)，两次不同型号的树脂前后过柱，效果要好于两个同种型号的。
31、优选地，步骤(5)中，所述的水洗柱方式为先热纯水洗柱，再热碱水洗柱，然后热纯水洗柱至近中性；更优选地，所述的热纯水和热碱水温度为70-80℃；热碱水为2-5wt％的氢氧化钠和/或氢氧化钾水溶液；所述的热纯水和热碱水洗柱时，流速为1.5～2.5bv/h，热纯水和热碱水洗柱体积为1.5～2bv；热纯水洗柱至接近中性时，流速为1.5～2.5bv/h，
32、上柱后先用热纯水洗柱是为了在低极性条件下洗柱，利用较低极性的热纯水将树脂上的杂质及碱液洗脱；而后采用热碱水洗柱，一方面碱液可以中和树脂上的杂质，进一步除杂；另一方面热碱水极性较低，也是有助于树脂上杂质的除去。最后热纯水洗柱至接近中性，是为了洗脱树脂上的残留的碱液，便于后续解吸。
33、优选地，步骤(5)中，所述酸性醇水溶液ph值为1～3，酸为盐酸，乙醇体积分数为40-45％、温度为60～70℃。
34、经过上述一系列步骤，可将一次层析获得低含量罗汉果甜苷v的解吸液i予以回收；同时二次层析后即可一次性解吸即可获得高含量的罗汉果甜苷v产品。
35、优选地，步骤(6)中，所述的浓缩是以除去部分水和醇为目的，除去醇味为嗅觉未闻到醇味即可。浓缩方式为旋转蒸发式浓缩、降膜式浓缩、单效蒸发式浓缩、多效蒸发式浓缩中的任意一种。
36、优选地，步骤(7)中，纯水稀释为稀释至可溶性固形物含量为3～6％，膜过滤为截留分子量为4000～8000da。
37、优选地，步骤(8)中，所述阴离子交换树脂型号为lsi-010、d941、lxb-001中的任意一种，阴离子交换树脂柱体积与透过液中甜苷v含量比200～400:1(ml/g)；所述阳离子交换树脂型号为lx-t5、lxd-762、d732、lx-94中的任意一种，阳离子交换树脂柱体积与透过液中甜苷v含量比为200～400:1(ml/g)；阴离子交换树脂和阳离子交换树脂的流速独立为1～1.5bv/h，径高比独立为1:3～8。
38、优选地，步骤(9)中，所述的浓缩是以除去部分水和醇为目的，浓缩至可溶性固形物45～65％。浓缩方式为旋转蒸发式浓缩、降膜式浓缩、单效蒸发式浓缩、多效蒸发式浓缩中的任意一种；所述的干燥为以除去水分为目的，包括但不限于喷雾干燥、真空干燥、微波干燥、带式干燥、鼓风干燥中的一种；所述的干燥后还包括粉碎过筛处理，过100-200目。
39、本发明的原理为：
40、将新鲜或干燥后的罗汉果原料，以水位溶剂提取并初步固液分离后，用有机大分子絮凝剂除杂并再次固液分离、过超滤膜，获得初步除杂的澄清上柱液；随后上柱液脱气后上柱与带有保温层的大孔吸附树脂层析柱进行吸附，接着利用除杂能力强的碱水洗柱，然后利用过饱和氢氧化钙醇水溶液线性变温分段解吸。(氢氧化钙其溶解度随着温度的升高而降低，进而导致其ph值也随着温度的升高而降低进而影响其水溶液的极性；水的温度与极性也成相关性，温度升高，水的极性也会降低。选择过饱和氢氧化钙醇水溶液作为洗脱剂，其温度由0℃线性升高至70℃的过程中，氢氧化钙浓度在降低，洗脱剂ph值在逐渐升高，同时温度的升高也影响了洗脱剂的极性，极性在逐渐降低。即在洗脱前期，洗脱剂其ph值较高，具有较高的除杂能力，同时前期洗脱剂的极性较大，对罗汉果甜苷v具有较小的洗脱能力，所以采用线性洗脱方式，可以在前期较低的温度条件下有效除去杂质，保留罗汉果甜苷v，而在后期较高温度条件下，有效的将层析柱上的罗汉果甜苷v充分洗脱下来。同时，在较高温度条件下，水的极性会减弱，进而降低了整个洗脱剂体系的极性，可以实现在确保获得较低极性的洗脱剂前提下，不需要过高的乙醇体积分数，从而减低的乙醇使用量和其浓度。)
41、分段收集的较低含量解吸液i稀释后调酸，再次上不同型号树脂的层析柱，并依次进行热纯水、热碱水及热纯水洗柱，然后利用较高温度的酸性水溶液一次性洗脱。(将含有较低含量罗汉果甜苷v的解吸液i直接用纯水稀释后调节为酸性，其溶液体系为低体积分数的酸性乙醇水溶液，改变了上柱液的酸碱性，将其直接作为上柱液，可以在确保罗汉果甜苷v完全被树脂吸附的同时，也能有效的确保大量的杂质不被树脂吸附，大大提高了树脂的特异性吸附和洗脱效果。上柱后先用热纯水洗柱是为了在低极性条件下洗柱，利用较低极性的热纯水将树脂上的杂质及碱液洗脱。而后采用热碱水洗柱，一方面碱液可以中和树脂上的杂质，进一步除杂；另一方面热碱水极性较低，也是有助于树脂上杂质的除去。最后热纯水洗柱至接近中性，是为了洗脱树脂上的残留的碱液，便于后续解吸。)
42、接着将两次层析获得解吸液合并，常规手段进行脱色、脱盐、干燥后，即得高含量高收率的罗汉果甜苷v产品。
43、本发明方法的有益效果如下：
44、一、本发明方法提供了一种罗汉果甜苷v的工业制备方法，获得的产品中罗汉果甜苷v含量≥98％、收率≥96％。
45、二、本发明利用过饱和氢氧化钙醇水溶液变温线性解吸工艺，解吸过程中所使用的醇水溶液体积分数要求低，醇水体积分为40-50％即可，不需要常规得到高含量罗汉果甜苷v产品需要高体积分数醇水溶液，且减少了对醇的使用量。
46、三、本发明只需对现有工业化的层析柱加一夹层即可，容易实现工业化；本发明的方法设备要求低、工艺简单、对环境友好、实用性广，适用于规模化生产。
1.一种罗汉果甜苷v的工业制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述罗汉果为罗汉果鲜果或干果，鲜果罗汉果甜苷v的含量不低于0.36％；所述浸提为以水为浸提溶媒，通过罐式提取或者连续逆流提取方式提取；所述浸提罗汉果鲜果与水的料水质量比为1:2～5；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，大孔吸附树脂体积与原料中甜苷总质量比为40～100:1(ml/g)，径高比为1:3～8，上柱流速为0.5～1.0bv/h；所述的大孔吸附树脂的型号为d101、ab-8、lx-t28、lx-t5、lxd-762、lx-94中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，碱水为2-5wt％的氢氧化钠和/或者氢氧化钾水溶液，碱水洗柱的流速为1.5～2.5bv/h，碱水洗柱体积为1.5～2bv；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的线性解吸方式为柱温和解吸液的温度由0-5℃线性升高至60-70℃，升温速率为5～10℃/bv，流速为1.5～2.5bv/h；监控解吸液中罗汉果甜苷v的含量，以干重计，甜苷v含量≥90％停止收集解吸液i，开始收集解吸液ii；
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，稀释倍数为4～8倍；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸中的任意一种；所述ph值为1～4；
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的大孔吸附树脂型号为与步骤(2)中不同型号的任意一种树脂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选地，步骤(5)中，所述的水洗柱方式为先热纯水洗柱，再热碱水洗柱，然后热纯水洗柱至近中性；更优选地，所述的热纯水和热碱水温度为70-80℃；热碱水为2-5wt％的氢氧化钠和/或氢氧化钾水溶液；所述的热纯水和热碱水洗柱时，流速为1.5～2.5bv/h，热纯水和热碱水洗柱体积为1.5～2bv；热纯水洗柱至接近中性时，流速为1.5～2.5bv/h；
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，纯水稀释为稀释至可溶性固形物含量为3～6％，膜过滤为截留分子量为4000～8000da；和/或
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，所述的浓缩是以除去部分水和醇为目的，浓缩至可溶性固形物45～65％；浓缩方式为旋转蒸发式浓缩、降膜式浓缩、单效蒸发式浓缩、多效蒸发式浓缩中的任意一种；所述的干燥包括喷雾干燥、真空干燥、微波干燥、带式干燥、鼓风干燥中的一种；所述的干燥后还包括粉碎过筛处理，过100-200目。
