本发明属于生物分析检测，具体涉及一种基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法。
背景技术：
1、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)是一种在许多人体组织和器官中广泛存在的生物酶，主要存在于肝脏、肾脏、肠道、骨骼和胎盘中。它具有催化磷酸酯的水解和去磷酸化功能。正常情况下，成人血液中alp的活性范围为40u/l至190u/l。血液中alp水平的异常与各种病理过程密切相关，如碱性磷酸酶被认为是器官纤维化的靶向促进剂，还参与心血管纤维化等。抑制碱性磷酸酶可有效减轻心肌梗死诱导的心肌纤维化，这表明碱性磷酸酶可能是预防心肌梗死后心力衰竭的治疗靶点。因此，在生物医学研究中迫切需要通过快速准确的方法来检测细胞内/外、组织、体液等样本中的alp。
2、目前，各种生物分析方法已被用于检测alp，例如电分析方法、表面增强拉曼散射、酶联免疫吸附试验(elisa)、放射免疫试验、石英晶体微量天平、场效应晶体管(fet)、比色法、磁性共振成像和荧光方法等。但由于目前检测alp的各种生物分析方法中大多存在抗干扰能力差、步骤繁琐、需要大型仪器、成本高等缺陷，故alp的荧光检测方法出现了荧光探针、纳米材料、生化反应等多种领域交叉的研究趋势。现有技术中，已开发出多种荧光探针用于alp的荧光检测，这些方法在检测alp方面具有优异的性能，但它们通常会遇到复杂的有机合成步骤、有害的有机溶剂参与受体和成本增加等问题。如shenq等(biosensors&bioelectronics,2014,55(complete):187-194)报道了一种基于dna模板有机合成(dts)诱导的分子内g-四联体结构生成的新的荧光生物传感方法。结晶紫(cv)被选择为信号传导者，因其荧光可以通过与g-四联体的结合而大大增强。在这项实验中，铜离子的检测是通过dna模板依赖的点击化学反应连接分裂的g-四联体片段实现的，cv的荧光特性能够区分完整的g-四联体。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现有技术基于荧光检测碱性磷酸酶的方法检测步骤繁琐、抗干扰能力差、部分方法灵敏度低、成本高的技术问题，而提供一种基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法。
2、为达到上述目的，采用的技术方案如下：
3、一种基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
4、步骤一：将标准样品、待测样品分别与2-磷酸-抗坏血酸(aap)混合，得到多个反应体系，置于25℃～45℃水浴反应10min～60min，得到多个反应混合液；
5、所述标准样品包括多个含有不同浓度碱性磷酸酶的溶液；
6、步骤二：将修饰了炔基基团的单链核酸、修饰了叠氮基团的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸分别溶解在纯水中，配制成三种核酸溶液；
7、步骤三：将步骤二配制的三种核酸溶液混合均匀，分别加入步骤一的多个反应混合液，再分别加入铜离子和pbs缓冲溶液混匀，形成多个反应体系，置于15℃～30℃水浴反应0.1h～2.5h后，检测多个反应体系的荧光强度；
8、步骤四：以已知碱性磷酸酶浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到碱性凝酸酶浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据待测样品的荧光强度值，计算得出待测样品中碱性凝酸酶的浓度。
9、优选的是，所述步骤一中，含有不同浓度碱性磷酸酶的溶液的浓度范围为0～0.5u/ml；
10、更优选的是，所述标准样品为碱性磷酸酶的浓度分别为0u/ml、0.025u/ml、0.05u/ml、0.1u/ml、0.2u/ml、0.3u/ml、0.4u/ml、0.5u/ml的溶液。
11、优选的是，所述步骤一中，待测样品包括小牛血清、细胞裂解液、动物唾液、龈沟液、饲料中的一种。
12、优选的是，所述步骤一的反应体系中，2-磷酸-抗坏血酸的浓度为0.1～2mm。
13、优选的是，所述步骤二中，修饰了炔基基团的单链核酸和修饰了叠氮基团的单链核酸的tm值分别为15℃～30℃。
14、优选的是，所述步骤二中，修饰了炔基基团的单链核酸具有如seq id no:1～seqid no:4所示的一种或多种核苷酸序列结构；seq id no:1为5’-alkynyl-gaaact gatag-3’，seq id no:2为5’-ctaaat tccaa-alkynyl-3’，seq id no:3为5’-alkynyl-gaaactgaaac-3’，seq id no:4为5’-gttaat tcc aa-alkynyl-3’。
15、优选的是，所述步骤二中，修饰了叠氮基团的单链核酸具有如seq id no:5～seqid no:8所示的一种或多种核苷酸序列结构，seq id no:5为5’-ctaaat tcc aa-azide-3’，seq id no:6为5’-azide-gaaact gatag-3’，seq idno:7为5’-gtt aat tcc aa-azide-3’，seq id no:8为5’-azide-gaaact gaaac-3’。
16、优选的是，所述步骤二中，作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸包括一条发夹结构的长单链，且其上修饰有荧光基团和猝灭基团，tm值30℃～60℃。
17、优选的是，所述步骤二中，作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸具有如seq id no:9～seq id no:12所示的一种或多种核苷酸序列结构，seq idno:9为5’-fam-tcg ctatca gtt tct tggaat tta gcg a-dabcyl-3’，seq id no:10为5’-dabcyl-tcg cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-fam-3’，seq id no:11为5'-fam-tcggtt tca gtt tct tgg aat taa ccg a-dabcyl-3'，seq id no:12为5'-tamra-cg gtt tcagtt tct tggaat taaccga-dabcyl-3’。
18、优选的是，所述步骤三的反应体系中，修饰了炔基基团的单链核酸、修饰了叠氮基团的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸的浓度比例为(1～5)：(1～5)：1。
19、优选的是，所述步骤三的反应体系中，修饰了炔基基团的单链核酸、修饰了叠氮基团的单链核酸的终浓度相同，都为10nm～80nm；作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸的终浓度为5nm～30nm。
20、优选的是，所述步骤三的反应体系中，pbs缓冲溶液的浓度为40mm，ph6.6～9.0，pbs缓冲溶液的盐为nacl，盐浓度为10mm～50mm。
21、优选的是，所述步骤三的反应体系中，铜离子浓度为50mm～1000mm。
22、优选的是，所述步骤三中，采用荧光分光光度计检测反应体系的荧光强度。
23、本发明的检测原理是：修饰了炔基基团的单链核酸和修饰了叠氮基团的单链核酸在较低温度下与作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸杂交形成双链，从而拉近叠氮及炔基基团的距离，使其相互靠近，加快反应速率。若体系中有alp存在，则alp将催化2-磷酸-抗坏血酸(aap)的磷酸根水解生成抗坏血酸(aa)，从而还原铜离子，进而催化模板有机合成反应的发生，即催化相邻的叠氮和炔基之间发生环加成反应，将两个分别标记有叠氮基和炔基的短单链核酸形成的缺口通过化学键连接形成长链核酸，其tm值升高，继而和标记有荧光基团和猝灭基团的长单链发夹结构的核酸形成稳定的dna双链，因其tm值高于发夹结构核酸本身的tm值，因此发夹结构被打开，其荧光基团和猝灭基团因发夹结构打开而远离，fret效应消失，荧光恢复，荧光强度升高，其荧光强弱与体系中alp浓度呈正相关，从而可以通过荧光强弱检测alp浓度。
24、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25、本发明利用alp水解产物引发的模板有机合成反应打开发夹结构从而增强荧光的性质，通过荧光增强的程度来检测alp。该发明通过模板有机合成反应使反应基团相互靠近，加快了反应速率，使其表现出高灵敏度；同时该发明具有酶和铜催化的反应特异性，因此该发明具有优良的抗干扰能力；而且本发明反应条件温和，稳定性好。
26、本发明所用材料试剂均为市售，成本低、性质稳定，不需要复杂繁琐的制备过程和预处理过程，只需要简单的溶液混合和溶液的温育过程，操作简便、采用的是标记了荧光基团和猝灭基团广泛应用的dna长单链，生物适应性强，基本无毒害，检测过程简单。
27、同时，本发明采用的荧光增强模式，能大大消除出现假阳性信号的可能性；本发明的检测方法稳定性好、灵敏度高，在0～500u/l范围内有很好的线性响应，检测限低至0.0367u/l。
1.基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤一中，含有不同浓度碱性磷酸酶的溶液的浓度范围为0～0.5u/ml；
3.根据权利要求2所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述标准样品为碱性磷酸酶的浓度分别为0u/ml、0.025u/ml、0.05u/ml、0.1u/ml、0.2u/ml、0.3u/ml、0.4u/ml、0.5u/ml的溶液。
4.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤一中，待测样品包括小牛血清、细胞裂解液、动物唾液、龈沟液、饲料中的一种。
5.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述修饰了炔基基团的单链核酸具有如seq id no:1～seq id no:4所示的一种或多种核苷酸序列结构；
6.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸包括一条发夹结构的单链，且其上修饰有荧光基团和猝灭基团，tm值30℃～60℃；
7.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三的反应体系中，修饰了炔基基团的单链核酸、修饰了叠氮基团的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸的浓度比例为(1～5)：(1～5)：1。
8.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三的反应体系中，修饰了炔基基团的单链核酸和修饰了叠氮基团的单链核酸的终浓度相同，都为10nm～80nm；作为连接模板的修饰了荧光基团和猝灭基团的发夹结构核酸的终浓度为5nm～30nm。
9.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三的反应体系中，pbs缓冲溶液的浓度为40mm，ph 6.6～9.0，pbs缓冲溶液的盐为nacl，盐浓度为10mm～50mm；
10.根据权利要求1所述的基于模板有机合成检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三中，采用荧光分光光度计检测反应体系的荧光强度。
