本发明涉及一种甘薯近缘野生种的遗传转化方法，属于植物遗传转化。
背景技术：
1、据了解，甘薯近缘野生种具有丰富的遗传多样性和潜在的基因资源，如高淀粉、抗病虫、耐病毒、抗寒抗旱等优良特性，对于丰富甘薯种质资源和品种改良有重要价值。其中，i.trifida是一种生长在加勒比海附近的甘薯近缘野生种，以二倍体、四倍体、六倍体等形式存在，它是栽培甘薯的野生祖先，是研究甘薯育种和分子分析的良好模式物种。目前对于甘薯六倍体的研究较多，目前对于甘薯六倍体的研究较多，但由于六倍体甘薯的遗传背景复杂，转化效率低，培育周期长，一些优良品种的选育很难维持。国内外对于甘薯的育种中已应用到了i.trifida，日本利用其培育出了高产抗线虫且具有高淀粉特性的新品种南丰，而江苏省农科院则利用它与甘薯杂交培育出了具有丰产，高淀粉以及抗病特性的新品系宁180和宁58-5。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种甘薯近缘野生种的遗传转化方法，通过培育二倍体i.trifida的胚性愈伤组织，并调整培养参数，大大提高了遗传转化效率。
2、本发明提供一种甘薯近缘野生种的遗传转化方法，包括以下步骤：
3、步骤一、取甘薯近缘野生种的茎尖进行培养至出现胚性愈伤组织；转至步骤二；
4、步骤二、将胚性愈伤组织在温度为26～28℃的条件下进行光照培养，获得致密的黄绿色胚性愈伤组织；转至步骤三；
5、步骤三、将致密的黄绿色胚性愈伤组织进行胚性愈伤组织的增殖培养，在温度为26～28℃条件下进行光照培养，三周继代一次，获得致密的黄色胚性愈伤组织；转至步骤四；
6、步骤四、挑取致密的黄色胚性愈伤组织，将目的基因进行二倍体的遗传转化；转至步骤五；
7、步骤五、取100～200mg/团、长势良好并且稳定增殖的胚性愈伤组织，将浸染液与愈伤组织共培养；转至步骤六；
8、步骤六、将经过共培养的愈伤组织进行过渡培养；转至步骤七；
9、步骤七、将过渡培养的愈伤组织进行抗性筛选；转至步骤八；
10、步骤八、将抗性筛选后的愈伤组织进行体胚发生。
11、本发明通过培育二倍体i.trifida的胚性愈伤组织建立遗传转化体系，具有遗传背景较为简单，转化效率较高，培育周期短等优点，为今后甘薯在培育杂交新品系和基因工程方面提供了重要手段。
12、作为本发明进一步优化的技术方案如下：
13、进一步的，所述植物表达载体携带的目的基因为hyg抗性基因；所述甘薯近缘野生种品种为i.trifida、i.triloba、i.nil。
14、所述步骤一中，将i.trifida、i.trioloba、i.nil三种甘薯近缘野生种的茎尖分别接种于ms改良培养基中，进行16h光照和8h黑暗培养直至出现胚性愈伤组织，培养温度为26～28℃；所述ms改良培养基为含0.5mg/l或1mg/l的4-fa、1mg/l或2mg/l的2,4-d、0.65mg/l或1.3mg/l的2,4,5-t的ms固体培养基。
15、本发明中，0.5mg/l 4-fa最有利于i.trifida的愈伤组织的诱导。4-fa、2,4-d、2,4,5-t这三种激素都可以诱导出i.nil愈伤组织，而且愈伤组织质量较好，呈金黄色；而这三种激素对i.triloba的诱导效果极差，诱导率低，诱导出的愈伤组织多呈现水渍化，后面即使对i.triloba的愈伤组织多次继代培养，也没有诱导出胚性愈伤组织。并且光照条件下的愈伤组织诱导率以及形成的愈伤状态均比在黑暗条件下好；上述三种激素均无法诱导出i.triloba的胚性愈伤组织；i.nil的胚性愈伤组织诱导率均较高，但它无法形成完整的植株。因此，选择二倍体i.trifida的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
16、所述步骤二中，胚性愈伤组织接种于含有0.5mg/l 4-fa和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行光照培养。所述步骤二中，光照培养条件为：16h光照和8h黑暗，温度26～28℃。
17、所述步骤三中，将生长良好的胚性愈伤组织转入含有0.5mg/l 4-fa和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中，进行胚性愈伤组织的增殖培养。
18、所述步骤四中，将目的基因通过农杆菌侵染法进行二倍体i.trifida的遗传转化。
19、所述步骤五中，将浸染液与愈伤组织置于0.5mg/l 4-fa、20mg/l as和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中共培养。
20、所述步骤六中，将经过共培养的愈伤组织放入到含有0.5mg/l 4-fa、200mg/l cef和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行过渡培养；过渡培养条件为：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间7天。
21、所述步骤七中，将过渡培养的愈伤组织置于0.5mg/l 4-fa、200mg/l cef、10mg/lhyg和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行抗性筛选；抗性筛选条件为：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间为4周，2轴时更换一次培养基。
22、所述步骤八中，将抗性筛选后的愈伤组织放入200mg/l cef、10mg/l hyg、1mg/laba和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行体胚发生；体胚诱导的条件：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间1～2周。
23、本发明建立了甘薯近缘野生种i.trifida的遗传转化体系，通过农杆菌诱导二倍体i.trifida胚性愈伤组织，获得转基因植株的遗传转化体系的建立。首先采集甘薯近缘野生种二倍体i.trifida的芽尖进行剥离，获得胚性愈伤组织，进行适当光照培养；胚性愈伤组织转入培养基中进行增殖培养；选取取携带目的基因质粒的根癌农杆菌，制备侵染液；将胚性愈伤组织放入侵染液中进行侵染，侵染后的愈伤先黑暗培养后光照恢复培养；最后进行抗性愈伤的筛选，得到候选植株，对候选植株进行pcr检测，将均为阳性的植株进行炼苗和移栽，得到二倍体i.trifida转基因植株。总之，本发明通过培育二倍体i.trifida的胚性愈伤组织，并调整培养参数，大大提高了遗传转化效率。
24、与现有技术相比，本发明方法获得的胚性愈伤组织转化率高达16.5％，培育周期仅需4个月。同时，二倍体i.trifida的遗传转化体系可为规模化培育新品种、定向改造优良性状和基因工程方面提供帮助。
1.一种甘薯近缘野生种的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述植物表达载体携带的目的基因为hyg抗性基因；所述甘薯近缘野生种品种为i. trifida、i. triloba、i. nil。
3.根据权利要求2所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤一中，将i. trifida、i. trioloba、i. nil三种甘薯近缘野生种的茎尖分别接种于ms改良培养基中，进行16h光照和8h黑暗培养直至出现胚性愈伤组织，培养温度为26～28℃；所述ms改良培养基为含 0.5 mg / l 或1 mg / l 的4-fa、1 mg / l或2 mg / l的2, 4-d、0.65mg / l或1.3 mg / l的2, 4, 5-t的ms固体培养基。
4.根据权利要求1所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤二中，胚性愈伤组织接种于含有0 . 5mg/l 4-fa和5 .0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行光照培养；所述步骤二中，光照培养条件为：16h光照和8h黑暗，温度26～28℃。
5.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤三中，将生长良好的胚性愈伤组织转入含有0 . 5mg/l 4-fa和5 .0g/l植物凝胶的ms改良培养基中，进行胚性愈伤组织的增殖培养。
6.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤四中，将目的基因通过农杆菌侵染法进行二倍体i. trifida的遗传转化。
7.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤五中，将浸染液与愈伤组织置于0.5 mg / l 4-fa、20 mg / l as和5 .0g/l植物凝胶的ms改良培养基中共培养。
8.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤六中，将经过共培养的愈伤组织放入到含有0.5 mg / l 4-fa、200 mg / l cef和5 .0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行过渡培养；过渡培养条件为：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间7天。
9.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤七中，将过渡培养的愈伤组织置于0.5 mg / l 4-fa、200 mg / l cef、10 mg / l hyg和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行抗性筛选；抗性筛选条件为：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间为4周，2周时更换一次培养基。
10.根据权利要求3所述一种甘薯近缘野生种遗传转化方法，其特征在于，所述步骤八中，将抗性筛选后的愈伤组织放入200 mg / l cef、10 mg / l hyg、1 mg / l aba和5.0g/l植物凝胶的ms改良培养基中进行体胚发生；体胚诱导的条件：16h光照和8h黑暗，温度为26～28℃，培养时间1～2周。
