本发明属于生物医学检测，涉及一种荧光定量pcr试剂盒及其应用，具体涉及鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒。
背景技术：
1、鸡毒支原体(mg)是最具致病性和造成经济损失最大的禽类支原体病原。给养禽业带来的经济损失主要有以下几个方面，降低鸡肉的品质、降低胴体质量、引起蛋鸡产蛋量降低、商品鸡饲料转化率降低、蛋壳质量下降、种鸡的胚胎孵化率降低、疫病防控的支出包括疫苗花费和药物花费、以及疫病监测的花费、淘汰阳性鸡的损失等。研究表明，mg感染可使蛋鸡产蛋率降低10％-20％、肉仔鸡增重率降低10％-20％、饲料转化率降低10％-20％、死亡率升高5％-10％、胚胎死亡率增加5％-10％。除此之外，mg的感染会对国际贸易造成严重的影响。所以mg已成为全球养禽业面临的最昂贵的传染病之一。
2、mg可垂直传播与水平传播，垂直传播的传染病首选防控方法为种群净化，一些发达国家如美国通过家禽改良计划基本实现种禽mg净化，但种禽净化在我国实施难度较大。目前我国防控mg感染的主要方法是疫苗接种，其中使用最广泛的是弱毒活疫苗，常用的包括f株、ts-11株和6/85株。
3、随着弱毒活疫苗的应用，又一新的问题急需解决，即如何鉴别野毒株与疫苗株以及评价疫苗接种效果。随着测序技术的发展以及mg菌株的分离，mg野毒株以及疫苗株的全基因组测序已完成，野毒株与疫苗株在部分基因位点存在稳定的差异，之前已有一些研究基于这些差异位点建立了一些鉴别方法。
4、随机扩增多态性dna(rapd)或任意引物聚合酶链反应(ap-pcr)是一种dna指纹鉴定方法，已被证明是非常有用的菌株分型技术。这种技术的缺点是rapd条带模式容易变异，难以复制和解释并且重复性较低。扩增片段长度多态性(aflp)提供了准确和可重复的菌株分型，但操作程序复杂且需要专门设备。以上两种dna指纹鉴定方法需要对病原进行分离培养。之后出现了无需分离培养的鉴别技术，这些技术以pcr原理为基础。针对不同细胞黏附相关基因的pcr鉴定技术，出现的限制性内切酶片段长度多态性(pcr-rflp)和高分辨率熔解曲线分析(pcr-hrm)的pcr已被用于mg菌株的鉴定。此外，还有核心基因组多位点序列分析(multilocus sequence typing,mlst)和错配扩增突变分析(mismatch amplificationmutation assays，mamas)也广泛用于mg的鉴别诊断，其中mama法有两种判定方法选择，一种是通过琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物大小，其缺点是灵敏度较低；另一种是通过pcr产物熔解曲线分析溶解温度(tm)值差异区分不同的pcr扩增产物，操作简单且特异性和敏感性较好，但在临床样品检测中存在一定的局限性。目前已有的鉴别方法均存在一些不足且无法实现定量检测，临床需根据野毒株与疫苗株的检出占比来分析防控情况，并且需实现定量检测来评估野毒感染严重程度以及疫苗接种效果。
5、现阶段我国防控mg感染依赖疫苗接种，使用最广泛的是弱毒活疫苗，目前我国批准使用的mg弱毒活疫苗包括f株、ts-11株以及6/85株，三种疫苗株均能产生良好的免疫效果，引起黏膜免疫和占位保护效应。随着活疫苗的广泛使用，建立区分疫苗免疫和野毒感染的鉴别检测方法对于评价疫苗免疫效果和监测野毒感染水平就非常有必要。但目前缺乏一种可实现定性、定量的检测方法来实现mg强弱毒鉴别诊断，来监测被免疫鸡群野毒感染情况与弱毒活疫苗定植效果。
技术实现思路
1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于鸡毒支原体野毒株的crma基因的第3141～3156位设计的引物探针在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与鸡毒支原体疫苗株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
2、本发明还要解决的技术问题是提供了引物探针组合。
3、本发明还要解决的技术问题是提供了引物探针组合在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
4、本发明最后要解决的技术问题是提供了一种可定量检测并区分mg野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒。
5、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于鸡毒支原体野毒株的crma基因的第3141～3156位设计的引物探针在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与鸡毒支原体疫苗株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
6、其中，所述鸡毒支原体疫苗株为f株时，其crma基因的第2126-2142位发生突变，具体为第2131位由t突变为a、第2133位由a突变为c、第2137位由g突变为c。
7、其中，所述鸡毒支原体疫苗株为f株时，其crma基因的第3147位由t突变为c、第3156位由g突变为a；所述鸡毒支原体疫苗株为ts-11株时，其crma基因的第3147位由t突变为g；所述鸡毒支原体疫苗株为6/85株时，其crma基因的第3142-3152位发生缺失。
8、本
技术实现要素：
还包括引物探针组合，所述引物探针组合包括基于鸡毒支原体野毒株的crma基因的第3141～3156位设计的引物探针，所述鸡毒支原体野毒株的引物序列如seqid no.1和seq id no.2所示，所述探针序列如seq id no.3所示；或/和基于f株的crma基因的第2126-2142位设计的引物探针，所述f株的引物序列如seq id no.4和seq id no.5所示，所述探针序列如seq id no.6所示；或/和基于ts-11株的potc基因的第518-534位设计的引物探针，所述ts-11株的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，所述探针序列如seq id no.9所示；或/和基于6/85株的gapa基因的第1307-1322位设计的引物探针，所述6/85株的引物序列如seq id no.10和seq id no.11所示，所述探针序列如seq id no.12所示。
9、本发明内容还包括所述的引物探针组合在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
10、本发明内容还包括鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒，其包含所述的引物探针组合。
11、其中，所述的试剂盒中还包括2×qpcr扩增预混液(2×qpcr probe master mix)、阴性标准品以及阳性标准品。
12、其中，所述阳性标准品包括含有mg野毒株和3种疫苗株的特异性检测基因片段的质粒。其中，野毒株特异性检测基因片段序列如seq id no.13所示，f株特异性检测基因片段序列如seq id no.14所示，ts-11株特异性检测基因片段序列如seq id no.15所示，6/85株特异性检测基因片段序列如seq id no.16所示。
13、其中，用于鉴别mg野毒株与f株、ts-11株、6/85疫苗株时，按照以下步骤进行：
14、(1)提取待检测样本的总dna；
15、(2)荧光定量方法标准曲线建立将阳性标准品质粒从108拷贝/μl到101拷贝/μl梯度稀释作为模板，以所述的引物和探针进行荧光定量pcr扩增，用于建立标准曲线；
16、(3)以步骤(1)提取的总dna为模板，以所述的引物探针组合进行荧光定量pcr扩增；
17、(4)pcr反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据ct值定性判断，判断标准：ct值＞37或无特异性荧光曲线判定为阴性、35≤ct值≤37判定为可疑、30≤ct值＜35判定为弱阳性、ct值＜30判定为阳性；
18、(5)步骤(4)中读取的ct值可依据标准曲线计算拷贝数，实现定量检测。
19、其中，步骤(2)的pcr扩增体系包括2×qpcr probe master mix，引物探针组合，其中引物包括mg野毒鉴别检测pcr上游引物与其中任意一种mg疫苗株鉴别检测pcr上游引物，mg野毒鉴别检测pcr下游引物与相对应的mg疫苗株鉴别检测pcr下游引物，mg野毒检测探针与相对应的疫苗株鉴别检测探针，所述引物浓度均为2～10μm，所述探针浓度均为1～5μm，dna模板，灭菌水。
20、其中，步骤(2)的pcr扩增体系为20μl；体系里含有10μl 2×qpcr probe mastermix，2μl引物/探针组合，其中引物/探针组合包括4μm mg野毒鉴别检测pcr上游引物(mg-w-uni-f)与其中任意一种mg疫苗株鉴别检测pcr上游引物(mg-f36-f、mg-ts11-f、mg-6/85-f)，4μm mg野毒鉴别检测pcr下游引物(mg-w-uni-r)与相对应的mg疫苗株鉴别检测pcr下游引物(mg-f36-r、mg-ts11-r、mg-6/85-r)，2μm mg野毒检测探针(mg-w-uni-p)与相对应疫苗株检测探针(mg-f36-p、mg-ts11-p、mg-6/85-pv)，2μl dna模板与灭菌水补足至20μl。
21、其中，优选的，反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环；60℃30s时收集荧光信号(程序需设置fam与vic双荧光通道)。
22、其中，鉴别检测体系配制建议按照n+1+1+1进行配制，其中，n是检测样本数量，1≤n≤93，1分别代表阴性质控、野毒阳性质控与对应疫苗毒阳性质控。
23、按照上述体系配制相应数量的反应体系，瞬时离心后分装至0.2ml荧光定量pcr管中，每管分装18μl，移至核酸提取区进行加样，样品检测管加入2μldna模板样品，阳性质控反应管加入2μl相应的阳性质粒，做好相应标记后瞬时离心进行检测。
24、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明的试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好，能同时准确实现mg野毒株与疫苗株(f株、ts-11株、6/85株)的鉴别检测，既可用于对已经经过分离培养并纯化的mg分离株进行鉴别，也可用于免疫鸡群弱毒活疫苗(f株、ts-11株、6/85株)在体内复制效率评估与野毒感染的监测，在确保特异性和敏感性的同时实现快速准确检测；能够同时实现对mg野毒株和疫苗株的定性和定量鉴别检测；既可用于已经经过分离纯化的mg菌株鉴别检测，也能用于临床样品中野毒株和疫苗株共存状态下的鉴别检测。
25、此外，4套分别针对野毒株和3种疫苗株的pcr引物与mgb-taqman探针可以进行组合使用，本发明证明了野毒检测体系分别与3种疫苗株检测体系进行组合进行双重qpcr检测，测试结果显示双重qpcr可以同时实现野毒株与疫苗株的鉴别检测，且灵敏度较好。
1.基于鸡毒支原体野毒株的crma基因的第3141~3156位设计的引物探针在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与鸡毒支原体疫苗株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡毒支原体疫苗株为f株时，其crma基因的第2126-2142位发生突变，具体为第2131位由t突变为a、第2133位由a突变为c、第2137位由g突变为c。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡毒支原体疫苗株为f株时，其crma基因的第3147位由t突变为c、第3156位由g突变为a；所述鸡毒支原体疫苗株为ts-11株时，其crma基因的第3147位由t突变为g；所述鸡毒支原体疫苗株为6/85株时，其crma基因的第3142-3152位发生缺失。
4.引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括基于鸡毒支原体野毒株的crma基因的第3141~3156位设计的引物探针，所述鸡毒支原体野毒株的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，所述探针序列如seq id no.3所示；或/和基于f株的crma基因的第2126-2142位设计的引物探针，所述f株的引物序列如seq id no.4和seq id no.5所示，所述探针序列如seq id no.6所示；或/和基于ts-11株的potc基因的第518-534位设计的引物探针，所述ts-11株的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，所述探针序列如seq idno.9所示；或/和基于6/85株的gapa基因的第1307-1322位设计的引物探针，所述6/85株的引物序列如seq id no.10和seq id no.11所示，所述探针序列如seq id no.12所示。
5.权利要求4所述的引物探针组合在制备鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。
6.鉴别鸡毒支原体野毒株与f株、ts-11株、6/85株的实时荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，其包含权利要求4所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括2×qpcr扩增预混液以及阳性标准品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品包括含有mg野毒株和3种疫苗株的特异性检测基因片段的质粒，。
9.权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，用于鉴别mg野毒株与f株、ts-11株、6/85疫苗株时，按照以下步骤进行：
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2）的pcr扩增体系包括2×qpcrprobe master mix，引物探针组合，其中引物包括mg野毒鉴别检测pcr上游引物与其中任意一种mg疫苗株鉴别检测pcr上游引物，mg野毒鉴别检测pcr下游引物与相对应的mg疫苗株鉴别检测pcr下游引物， mg野毒检测探针与相对应的疫苗株鉴别检测探针，所述引物浓度均为2~10μm，所述探针浓度均为1~5μm，dna模板，灭菌水。
