本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种检测人血清中抗磷脂酶a2受体抗体浓度的试剂盒及其应用。
背景技术：
1、膜性肾病(membrane nephrology,mn)属于自身免疫性疾病，是肾病综合征的一种常见病理类型，其中约有80％为特发性膜性肾病(idiopathic membrane nephrology,imn)。imn是成人慢性肾病的最常见病理型之一，其病理特征是肾小球基底膜外侧上皮下免疫复合物沉积导致基底膜弥漫性增厚，临床上主要表现为肾病综合征或无症状性蛋白尿。
2、2009年首次提出imn的自身免疫机制，并确定pla2r(phospholipase a2receptor,磷脂酶a2受体)是imn的主要靶标抗原，pla2r在正常足细胞上表达，并存在于imn患者肾小球的免疫沉积物中。血清中抗磷脂酶a2受体抗体(anti-phospholipase a2 receptor igg,anti-pla2r igg)的水平可以用于imn的诊断和治疗监测，检出率可以达到70-80％，而在继发性膜性肾病或其他肾病中，anti-pla2r igg水平无显著升高。随着研究的深入，后续研究发现了其他imn靶标抗原，例如thsd7a、nrll-1等，但pla2r仍是imn的主要致病靶标抗原。及时诊断和合理干预对延缓imn患者的疾病进程具有重要意义，有助于减少终末期肾病(end-stage renal disease,esrd)的发生。
3、目前，文献报道、专利公开以及临床应用中anti-pla2r igg的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(elisa)、荧光免疫法(ifa)和化学发光法(clia)。其中，elisa是国内外临床应用最广的检测方法。尽管其应用广泛，但仍存在灵敏度低、操作复杂、耗时长及自动化程度低等问题。ifa虽然灵敏度高，但操作复杂且耗时长，部分检测试剂需要手工操作和显微镜观察，且依赖于操作人员的经验。clia虽然具有高灵敏度和高自动化，显著提升了检测效率，但其试剂和设备成本较高。
4、在临床检测中，检测方法的重复性、经济性和时效性尤为关键。现有检测方法尽管各有优点，但也存在一定的局限性。因此，需要对其进行改进。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供一种微球-pla2r偶联物，其包含蛋白包被的胶乳微球和pla2r抗原，所述蛋白包被的胶乳微球和pla2r抗原通过接头(linker)共价相连。
2、进一步的，所述胶乳微球为聚苯乙烯微球，所述pla2r抗原为重组抗原，所述蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的任意一种或几种。
3、进一步的，所述聚苯乙烯微球直径为50-450nm，所述聚苯乙烯微球表面带有羧基官能团。
4、进一步的，所述接头为以下结构中的任意一种：
5、
6、进一步的，所述结构式中n端连接所述pla2r抗原，s端连接所述蛋白包被的胶乳微球。
7、本发明第二方面提供一种微球-pla2r偶联物的制备方法，包括以下步骤：
8、s1：将pla2r和异双功能交联剂加入活化缓冲液中反应，得到pla2r-ma；
9、s2：将聚苯乙烯微球、edc和nhs加入上述活化缓冲液中，进行微球活化，加入载体蛋白进行蛋白包被，得微球-载体蛋白偶联物；
10、s3：将s2得到的微球-载体蛋白偶联物分散在巯基化缓冲液中，加入巯基化试剂进行修饰，得到巯基化微球混悬液；
11、s4：将pla2r-ma加入到s3中的巯基化微球混悬液中进行反应，得到微球-pla2r偶联物。
12、进一步的，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的任意一种或几种。
13、进一步的，所述活化缓冲液包括mes、pbs和碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或几种。
14、进一步的，所述巯基化试剂包括satp/nh2oh·hcl、traut’s reagent、tcep、dtt和spdp/dtt中的任意一种或几种。
15、进一步的，所述巯基化缓冲液包括mes、pbs和碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或几种，其中添加1-10mm edta防止二硫键生成。
16、进一步的，所述异双功能交联剂包括smcc、smpb和nhs-peg4-maleimide中的任意一种或几种。
17、本发明第三方面提供一种抗磷脂酶a2受体抗体检测试剂盒，包括试剂1、试剂2；其中，所述试剂1包括缓冲液、电解质、稳定剂、促进剂、表面活性剂和防腐剂；所述试剂2包括前述微球-pla2r偶联物、缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
18、进一步的，所述试剂1包括10-200mm的缓冲液、0.1-1％w/w的电解质、0.1-15％w/w的稳定剂、0.5-1.5％w/w的促进剂、0.05-1％w/w的表面活性剂和0.01-0.1％w/w的防腐剂。
19、进一步的，所述试剂2包括0.05-0.2％w/w的微球-pla2r、10-200mm的缓冲液、0.1-1％w/w的电解质、0.1-15％w/w的稳定剂、0.05-1％w/w的表面活性剂和0.01-0.1％w/w的防腐剂。
20、进一步的，所述检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括0-1500ru/ml的anti-pla2r igg、10-200mm的缓冲液、0.1-15％w/w的稳定剂和0.01-0.1％w/w的防腐剂。
21、进一步的，所述试剂1、所述试剂2或所述校准品的ph为7.4。
22、进一步的，所述缓冲液为pbs、tris、mes、hepes、碳酸氢钠缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液和柠檬酸缓冲液中的任意一种或几种。
23、进一步的，所述电解质为钠离子、镁离子、钾离子和钙离子中的任意一种或几种。
24、进一步的，所述稳定剂为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、海藻糖、蔗糖和甘露醇中的任意一种或几种。
25、进一步的，所述促进剂为peg-2000、peg-4000、peg-6000、peg-8000、peg-20000、pvp和pva中的任意一种或几种。
26、进一步的，所述表面活性剂为tween-20、tween-80和tritonx-100中的任意一种或几种。
27、进一步的，所述防腐剂为nan3和proclin 300中的任意一种或几种。
28、进一步的，所述anti-pla2r igg为单克隆抗体或多克隆抗体。
29、本发明还提供一种抗磷脂酶a2受体抗体的检测方法，使用如上述的抗磷脂酶a2受体抗体igg免疫比浊法检测试剂盒。
30、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
31、(1)本发明提供一种抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，其中的试剂2中添加微球-pla2r作为信号增强载体，能有效提升检测信号强度，从而显著提升试剂盒的检测灵敏度和线性范围，还确保了检测结果的准确性。
32、(2)本发明的试剂盒中微球-pla2r的制备方法不同于常规方法的直接偶联，本发明是将胶乳微球进行蛋白包被和linker修饰，增加其抗原载量，同时合适长度的linker避免了抗原有效表位被包裹，降低了抗原周围的空间位阻，保持了抗原的活性和特异性。使用此微球-pla2r的检测试剂盒灵敏度、线性范围、精密度、回收率均满足要求。
33、(3)本发明的抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，可用于全自动生化分析仪，测试速度快，能实现样本高通量测试，满足临床需求。
1.一种微球-pla2r偶联物，包含蛋白包被的胶乳微球和pla2r抗原，所述蛋白包被的胶乳微球和pla2r抗原通过linker共价相连，所述linker具有以下结构中的任意一种：
2.如权利要求1所述的微球-pla2r偶联物，其特征在于，所述胶乳微球为聚苯乙烯微球，所述pla2r抗原为重组抗原，所述蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的任意一种或几种。
3.如权利要求2所述的微球-pla2r偶联物，其特征在于，所述聚苯乙烯微球直径为50-450nm，所述聚苯乙烯微球表面带有羧基官能团。
4.如权利要求1-3任一项所述的微球-pla2r偶联物的制备方法，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的微球-pla2r偶联物的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的任意一种或几种；
6.一种抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂1、试剂2；其中所述试剂1包括缓冲液、电解质、稳定剂、促进剂、表面活性剂和防腐剂；所述试剂2包括如权利要求1-3所述的微球-pla2r偶联物、缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
7.如权利要求6所述的抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括10-200mm的缓冲液、0.1-1％w/w的电解质、0.1-15％w/w的稳定剂、0.5-1.5％w/w的促进剂、0.05-1％w/w的表面活性剂和0.01-0.1％w/w的防腐剂；
8.如权利要求6或7所述的抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1和所述试剂2的ph为7.4。
9.如权利要求8所述的抗磷脂酶a2受体抗体免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为pbs、tris、mes、hepes、碳酸氢钠缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液和柠檬酸缓冲液中的任意一种或几种；
10.一种非诊断目的的抗磷脂酶a2受体抗体的检测方法，使用如权利要求9所述的抗磷脂酶a2受体抗体igg免疫比浊法检测试剂盒。
