本发明属于植物细胞或组织，尤其涉及一种黄芪属植物干细胞分离培养的方法、细胞系及其应用。
背景技术：
1、植物和微生物能够合成大量次生代谢产物(secondary metabol ites)，又称天然产物。其在药品、香料、染料、色素、食品添加剂等领域具有悠久的应用历史。自1956年，routine和nicke l首次成功应用植物细胞培养技术生产目标次生代谢产物，此后大量相关研究涌现。据不完全统计，目前应用植物细胞培养技术研究的药用植物超过400种，分离得到的次生代谢产物超过600种。植物资源已经成为人类赖以生存的食物与药品的重要资源之一。
2、植物干细胞(p lant stem ce l l s)是植物体内具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。愈伤组织细胞(ddcs)和形成层分生组织细胞(cmcs)均有植物干细胞的功能，能形成新的植物组织和器官。愈伤组织细胞是指原植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织细胞。形成层分生组织细胞存在于植物的芽、根尖的顶端分生组织与茎形成层的侧生分生组织中，是先天存在、原始未分化、能主导组织产生的细胞。
3、愈伤组织悬浮培养技术已经发展了几十年，利用ddcs进行植物细胞悬浮培养来生产植物的目标次级代谢产物的技术已较为成熟，但仍存在诸多问题，例如不适于悬浮培养，脱分化植物细胞的异质性、细胞不耐剪切力、易聚集和沉降、易褐化、增殖速度低、产物含量低、细胞系冻存后存活率低以及细胞系的遗传稳定性差等，使得工业化应用困难。有研究表明相较于ddcs，cmcs的结构特性-薄细胞壁、大量小液泡和丰富的线粒体等，赋予了它们卓越的剪切力耐受性和高产能，使其更适于悬浮培养。然而，cmcs的分离和培养十分困难，时间周期长，开发植物cmcs的细胞系难度极高。由此可见，不管是分离培养ddcs还是cmcs进行悬浮培养都面临着各自的困难。
技术实现思路
1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种黄芪属植物干细胞分离培养的方法、细胞系及其应用。一方面解决了现有技术愈伤组织细胞悬浮培养存在的细胞不耐剪切力、易聚集和沉降、易褐化、增殖速度较低等一系列问题，另一方面解决了直接从植物中对形成层分生组织细胞进行分离培养存在的时间周期长且较为困难的技术问题。
2、本发明提供一个技术方案：一种黄芪属植物干细胞分离培养的方法，所述方法包括如下步骤：
3、s1、取植物种子发芽后的胚根组织，置于诱导培养基中进行培养；
4、s2、培养至胚根末端诱导生成愈伤组织细胞；
5、s3、分离出特征细胞。
6、优选的，所述特征细胞具有以下特征：(1)处于未分化状态；(2)为同质细胞；(3)细胞中含有大量小液泡；(4)表达wol基因。
7、优选的，所述黄芪属植物选自荚膜黄芪、蒙古黄芪。
8、优选的，所述s1包括：
9、s1.1、种子消毒；
10、s1.2、种子萌发；
11、s1.3、胚根诱导培养，得外植体。
12、优选的，所述s2包括：
13、s2.1、将外植体置于渗透剂溶剂中进行渗透处理；
14、s2.2、将渗透剂溶液处理后的外植体置于诱导培养上诱导培养，所述诱导培养基为含有生长素和细胞分裂素的ms培养基，培养得到无色透明细胞。
15、优选的，所述s3包括：
16、s3.1、取出上述无色透明细胞，置于分离培养基中进行培养，促进其分裂且不发生分化；
17、s3.2、取分离培养基中无色透明细胞进行检测，镜检观测到选取的细胞液内有大量小液泡；处于未分化状态；为同质细胞；基因检测细胞中表达wol基因。
18、优选的，还包括：
19、s4、收集特征细胞，进行增殖培养。
20、优选的，所述s4包括：
21、s4.1、将特征细胞置于继代培养基中培养；
22、s4.2、摇瓶培养。
23、本发明还提供一个技术方案：上述方法分离培养的黄芪属植物干细胞，所述细胞具有以下特征：(1)处于未分化状态；(2)为同质细胞；(3)细胞中含有大量小液泡；(4)表达wol基因。
24、本发明还提供一个技术方案：黄芪属植物干细胞在制备目的次级代谢产物中的应用，包括分离培养黄芪干细胞以提取其全谱生物活性物质，用于制备化妆品、保健品和医药产品。
25、有益效果：
26、本发明提供的黄芪属植物干细胞分离培养的方法，首次从黄芪愈伤组织中分离出处于未分化状态且液泡化程度低的干细胞，取黄芪胚根组织进行培养，获取愈伤组织，进而分离特征细胞以获得干细胞。不同于现有技术分离培养未充分分化的愈伤组织细胞，或直接从植物茎尖、根尖中分离培养形成层分生组织细胞，本发明方法通过培养获得愈伤组织，再从中筛选液泡化程度低的细胞进行诱导增殖培养。本发明方法对细胞培养分离的整个生长周期短且过程操作简便；提取的细胞活性成分一致性高，具有高分化和分裂能力；遗传稳定性高；具有卓越的剪切力耐受力；代谢产物含量高。本发明方法操作过程安全性高，无重金属等污染，生产效率高，不受自然环境因素影响。
27、本发明方法通过从ddcs中分离培养与cmcs结构特征相似的干细胞用于解决干细胞悬浮培养种子液的来源问题。一方面诱导愈伤组织较为容易，另一方面从ddcs中筛选分离出结构特征适于悬浮培养的细胞系。
1.一种黄芪属植物干细胞分离培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征细胞具有以下特征：(1)处于未分化状态；(2)为同质细胞；(3)细胞中含有大量小液泡；(4)表达wol基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黄芪属植物选自荚膜黄芪、蒙古黄芪。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s1包括：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s2包括：
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s3包括：
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述s4包括：
9.根据权利要求1-8任一所述的方法分离培养的黄芪属植物干细胞，其特征在于，所述细胞具有以下特征：(1)处于未分化状态；(2)为同质细胞；(3)细胞中含有大量小液泡；(4)表达wol基因。
10.根据权利要求9所述的黄芪属植物干细胞在制备目的次级代谢产物中的应用，其特征在于，所述应用包括分离培养黄芪干细胞以提取其全谱生物活性物质，用于制备化妆品、保健品和医药产品。
