分枝杆菌分型和耐药基因检测引物组、试剂盒的制作方法

    技术2024-12-14  11


    本发明涉及分枝杆菌检测领域,特别涉及分枝杆菌分型和耐药基因检测引物组、试剂盒。


    背景技术:

    1、分枝杆菌科是一个有5个属和超200多种分枝杆菌组成的,其中有很多导致哺乳动物产生严重疾病的病原体,比如结核分枝杆菌会引起慢性传染性疾病,在新冠病毒(covid-19)大流行之前,结核病是导致人类死于单一传染病的头号杀手,同时,它也是艾滋病病毒(hiv)携带者最主要的死亡原因以及与抗菌素耐药相关的主要致死性传染病。非结核分枝杆菌感染也在日益增加,ntm感染与结核分枝杆菌感染临床症状非常相似,在临床上极易误诊为结核分枝杆菌病,导致后续一系列不当的治疗手段,对患者的病情有一定影响,因此对感染菌株进行鉴定对于分枝杆菌感染性疾病的诊疗至关重要。

    2、耐药结核病分为很多种类型,其中耐多药结核病(mdr-tb)和广泛耐药结核病(xdr-tb)是造成结核病高致死率的两个最关键的原因。目前对于结核分枝杆菌耐药机制,主要有以下3种:(1)细胞壁结构与组成发生变化;(2)药物外排泵系统;(3)编码药物靶标的基因或药物活性有关的酶基因突变。临床上治疗分枝杆菌感染的药物一般有一线药物和二线药物,医生会采用两种或两种以上药物进行联合治疗。由于这是一个长期用药的过程,极其容易产生耐药性。由上可知,精准对分枝杆菌的耐药性进行检测,对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有非常重要的作用。

    3、目前临床上检测分枝杆菌及其耐药的方法有涂片法,传统的培养法,药敏试验,荧光pcr技术,genexpertmtb/rif(xpert)技术等。其中涂片法是最常见的方法之一,具有时效短,操作简单且成本低,但是存在灵敏度低易出现假阳性的结果;传统的培养法耗时较长,一般为2-8周,可能造成潜在的传播风险,特异性也较差,所有分型的分枝杆菌都可生长,必须与药物敏感性测试和分枝杆菌菌种鉴定相结合,才能确定是否为结核菌;药敏试验用时长,从痰标本收集、培养至药敏试验结果报告需要2.5个月,不能满足耐药结核病及时精准诊断及治疗;荧光pcr技术检测范围有限,只能针对少数分枝杆菌且已知的耐药基因和突变位点进行检测,影响检测准确性;目前的分子技术,可能因为通量较低无法覆盖所有耐药基因及突变类型,而可能出现假阴性,部分突变如同义突变(氨基酸没有改变),沉默突变(不影响编码蛋白的表达)等并不引起表型耐药,若采用不了解基因突变性质的检测技术有可能出现假阳性。

    4、近几年随着下一代测序(next generation sequencing,ngs)技术的兴起,它采用高通量测序技术,不仅可以降低成本,加快测序速度,还能保持高准确性,其中靶向测序(targetedngs,tngs)先通过靶向捕获特定基因后再进行高通量测序,具有能同时平行检测多个靶基因的特点。但二代测序其平台搭建成本高、试剂价格昂贵、测序时间长、读长短,难以覆盖全面的基因,且需要专业技术人员进行实验检测,极大地限制了测序技术在结核病领域的推广和应用,特别是结核病防治负担较大的国家和地区。目前的分枝杆菌临床常用的一代测序菌种鉴定方法多基于16srrna区域,但是16srrna区域分辨力不足,一些亲缘关系相近的菌种无法被准确鉴别,因此开发一种高效准确的分枝杆菌鉴定的方法学和引物组在结核病或者ntm病的检测中具有重要的应用价值。纳米孔测序是新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术。它能够直接实时监测核酸通过蛋白纳米孔时的电流变化来工作,解码这些电流信号以确定碱基序列,该测序技术能边测序边分析,大大缩短了测序时间,并且纳米孔测序读长长,更适合感染性疾病的快速筛查,特别是耐药基因检测无需拼接即可对耐药基因进行检测,能覆盖全长耐药基因,精准鉴定到snp位点。


    技术实现思路

    1、本发明的目的在于提出分枝杆菌分型和耐药基因检测引物组、试剂盒及检测方法,实现高灵敏性、高特异性、准确快速检测以适用于结核病辅助诊断。

    2、鉴于此,本发明的方案为:

    3、本发明的第一个方面,提供用于检测分枝杆菌分型的引物组合物,针对分枝杆菌感染中44种病原微生物序列进行设计,病原微生物如下所示:

    4、

    5、

    6、所述用于检测分枝杆菌分型的引物组合物包括核苷酸序列如seq id no:1-270所示的扩增引物对。

    7、进一步地,所述用于检测分枝杆菌分型的引物组合物还包括内参引物,核苷酸序列如seq id no:271-272所示。

    8、进一步地,所述各扩增引物对每条序列从5’末端向3’端方向依次插入有茎环寡核苷酸、公共序列;所述茎环寡核苷酸长度为4-6bp,与的序列3’端互补;所述公共序列如seqid no:325所示。

    9、本发明第二个方面在于,提出分枝杆菌分型检测试剂盒,包括以上第一个方面所述引物组合物。

    10、进一步地,所述检测试剂盒还包括标签引物;和/或dna聚合酶、mgcl、kcl、tris-hcl、dntp中的一种或多种。

    11、进一步地,所述检测试剂盒中各引物终浓度在5nm~100nm,优选10nm浓度。

    12、本发明第三个方面,提出用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物,针对一线、二线26种药物的26种耐药基因进行特异性设计,所述耐药基因如下:

    13、

    14、

    15、具体地,所述用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物包括核苷酸序列如seq idno:273-324所示的扩增引物对,可用于检测以上26种药物的26种耐药基因的任意已知突变。

    16、进一步地,所述用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物还包括内参引物,核苷酸序列如seq id no:271-272所示。

    17、进一步地,所述检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物中,各扩增引物对每条序列从5’末端向3’端方向插入有公共序列;所述公共序列如seq id no:325所示。

    18、本发明第四个方面,提出分枝杆菌耐药基因检测试剂盒,包括第三个方面所述的引物组合物;该试剂盒可用于预测耐药性,指导临床正确用药和有效控制结核病。

    19、进一步地,所述用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物还包括标签引物;和/或dna聚合酶、mgcl、kcl、tris-hcl、dntp中的一种或多种。

    20、进一步地,所述耐药基因检测试剂盒中各引物终浓度在5nm~100nm,优选50nm浓度。

    21、本发明第五个方面,还提供一种检测方法,用于分枝杆菌分型检测,或用于分枝杆菌耐药基因检测,该检测方法结合纳米孔测序时效性快、能在6小时内出结果,通量高、成本低、操作简单,灵敏度高,具有显著的临床应用价值。

    22、相对于现有技术,本发明的有益效果为:

    23、本发明所述用于检测分枝杆菌分型的引物组合物基于分枝杆菌感染中44种病原微生物基因进行的特异性设计,可用于分枝杆菌的准确分型,覆盖广、灵敏度高、特异度强;对感染菌株的鉴定和分枝杆菌感染性疾病的诊疗具有重要意义。

    24、本发明所述用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物基于分枝杆菌一线、二线26种药物的26种耐药基因特异性设计,可特异性进行耐药基因检测,覆盖广、灵敏度高、特异度强,对于指导分枝杆菌感染临床用药具有重要意义,便于有效控制结核病。


    技术特征:

    1.用于检测分枝杆菌分型的引物组合物,其特征在于,包括核苷酸序列如seq id no:1-270所示的扩增引物对。

    2.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,还包括内参引物,核苷酸序列如seqid no:271-272所示。

    3.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述各扩增引物对每条序列从5’末端向3’端方向依次插入有茎环寡核苷酸、公共序列;所述茎环寡核苷酸长度为4-6bp,与的序列3’端互补;所述公共序列如seq id no:325所示。

    4.分枝杆菌分型检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-3任意一项所述引物组合物。

    5.根据权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括标签引物;和/或dna聚合酶、mgcl、kcl、tris-hcl、dntp中的一种或多种。

    6.用于检测分枝杆菌耐药基因的引物组合物,其特征在于,包括核苷酸序列如seq idno:273-324所示的扩增引物对。

    7.根据权利要求6所述的引物组合物,其特征在于,还包括内参引物,核苷酸序列如seqid no:271-272所示。

    8.根据权利要求6所述的引物组合物,其特征在于,所述各扩增引物对每条序列从5’末端向3’端方向插入有公共序列;所述公共序列如seq id no:325所示。

    9.分枝杆菌耐药基因检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求6-8任意一项所述引物组合物。

    10.根据权利要求9所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括标签引物;和/或dna聚合酶、mgcl、kcl、tris-hcl、dntp中的一种或多种。


    技术总结
    本发明具体公开了分枝杆菌分型和耐药基因检测引物组、试剂盒,所述检测引物组基于分枝杆菌感染中44种病原微生物,以及一线、二线26种药物的26种耐药基因特异性设计,可用于分枝杆菌的精确分型,以及耐药基因检测,覆盖广、时效性快、灵敏度高、特异度强;对感染菌株的鉴定和分枝杆菌感染性疾病的诊疗用药提供指导,对于控制结核病具有重要意义。

    技术研发人员:王俊,宋驰,肖潇,余凯敏,刘思奕,曹静,程雨果,吴安琪,吴培,郭睿
    受保护的技术使用者:武汉贝纳医学科技有限公司
    技术研发日:
    技术公布日:2024/10/24
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