本公开涉及生物，特别地，本公开涉及一种高度靶向人类hla-a基因的sgrna、其组合物以及应用。
背景技术：
1、免疫排斥反应主要由受体免疫细胞识别非我的供体细胞表面的主要组织相容性复合物(mhc)分子介导，人类的mhc分子由人白细胞抗原(hla)基因所编码，经典的hla分子编码的hla-a、b、c和dr等为同种异体移植排斥反应的主要分子靶标。免疫排斥反应是造成很多治疗手段失败的重要原因。例如，造血干细胞(hsc)移植是治疗各种恶性血液系统疾病及免疫功能障碍的重要手段，hsc的移植成功首先需要克服移植的免疫屏障(免疫排斥)。
2、敲降或者敲除hla-a等可减少移植排斥反应，显著提高hla配型成功率和扩大临床级同种异体移植物的应用。已有研究通过锌指核酸酶(zfn)的方法敲除了脐血来源的造血细胞的hla-a基因，在提高了异基因移植的配型率的同时维持了造血细胞的体内植入和各谱系分化的能力。然而，zfn编辑hla-a基因的方法存在很多缺陷和不足。例如，1)zfn技术敲除hla-a基因效率较低，仅为10％左右，临床应用前景较差。2)zfn基因编辑易脱靶且产生的细胞毒性较高。zfn对dna的剪切需要两个fok i切割区域的二聚化，并且需要至少一个识别单元结合dna。dna识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但由于zfn剪切的过程并不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致dna的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。3)zfn的方法受到现有生物学领域研究手段的限制，在细胞内部操作的精确程度和后果都较难预料。如果zfn引起相关基因突变，则可能会导致一系列意想不到的后果，在与人体相关的应用领域，甚至可能引发癌症。到目前为止，zfn技术只能用于体外操作，在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。而直接向患者体内导入相关zfn元件进行基因编辑处理则具有较大的潜在风险，且效率不高。以上诸多限制导致zfn操作较为繁琐，难以推广应用。因此，目前尚无高效的敲降或者敲除例如人造血细胞的hla-a基因的有效手段，解决上述问题已是当务之急。
技术实现思路
1、解决的技术问题：
2、本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少高效地敲降和/或敲除人hla-a基因的有效手段地问题，提供了一种高度靶向人类hla-a基因的sgrna、其组合物以及应用。
3、具体地，本发明人创造性地设计了基于crispr基因编辑系统的小向导rna(sgrna，small guide rna)，其单独或组合应用于crispr基因编辑系统后能够高效地敲降和/或敲除人hla-a基因，从而解决了上述现有技术中的问题。
4、技术方案：
5、一种sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1-21之一所示。
6、在本公开的实施方式中，通过crispr基因编辑系统，利用上述sgrna在细胞中对人hla-a基因识别并敲降和/或敲除，其在293t细胞系效率均可以达到20％以上，在脐血来源的造血细胞上最高效率可达到97％，远优于现有技术中的方法。其中，hla-a-ex2-g13、hla-a-ex3-g167、hla-a-ex2-g452三条sgrna的效率最优。因此，作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
7、在本公开的一些实施方式中，上述如seq id no.1-21所示的核苷酸序列可以经过合理的修饰。所述修饰包括但不限于，为了改良目的的一个或多个核苷酸的取代、插入、缺失或交换或替换区域，以及利用其他基团对核苷酸序列进行的修饰。
8、本公开的另一个方面，是提供了一种sgrna的组合物，所述组合物包括一种或几种选自seq id no.1-21所示核苷酸序列的sgrna。
9、作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述组合物包括一种或几种选自seq idno.1、seq id no.2或seq id no.3所示核苷酸序列的sgrna。
10、在本公开的一些实施方式中，上述组合物中的核苷酸序列可以是经过修饰的。所述修饰包括但不限于，为了改良目的的一个或多个核苷酸的取代、插入、缺失或交换或替换区域，以及利用其他基团对核苷酸序列进行的修饰。
11、本公开的另一个方面，是提供了上述sgrna或上述组合物在制备用于敲除或敲降人hla-a基因的产品中的应用。所述敲除或敲降人hla-a基因可以为在体内进行或在体外培养环境中进行。
12、本公开的另一个方面，是提供了上述sgrna或上述组合物在制备预防或降低免疫排斥反应的药物中的应用。
13、本公开的另一个方面，是提供了一种重组载体，所述重组载体中包含上述核苷酸序列。在本公开的另一些实施方式中，上述重组载体中还可以同时装载编码cas蛋白的核苷酸序列。
14、本公开的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括上述sgrna、上述组合物或上述重组载体。在本公开的另一些实施方式中，所述试剂盒还包括cas蛋白或cas蛋白的表达载体。
15、本公开的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括上述sgrna、上述组合物或上述重组载体，以及药学上可接受的载体。
16、本公开的另一个方面，是提供了一种在细胞中提高人hla-a基因的敲除或敲降效率的方法，包括：
17、步骤1)向细胞中转入上述sgrna、上述组合物或上述重组载体；
18、步骤2)向细胞中转入cas蛋白或cas蛋白的表达载体；
19、步骤3)所述细胞生长。
20、在本公开的一些实施方式中，上述细胞可以在体内生长或在体外培养环境中生长。
21、有益效果：
22、本公开提供的sgrna可高效敲除或敲降人类的hla-a基因，并且几乎全部覆盖中国人群hla-a基因型的sgrna。本公开提供的sgrna具有高度的靶向性，在人的造血细胞中敲除或敲降hla-a基因后对其hla-b、hla-c和hla-ii类分子的表达无显著影响，细胞毒性低，在基因治疗方面显示出明显优势，在细胞治疗领域具有很大的临床应用前景。
1.一种sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.2之一所示。
2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述核苷酸序列是经过修饰的。
3.如权利要求1或2所述的sgrna在制备用于敲除或敲降人hla-a基因的产品中的应用。
4.如权利要求1或2所述的sgrna在制备预防或降低免疫排斥反应的药物中的应用。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中包含如权利要求1或2所述的sgrna的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包含编码cas蛋白的核苷酸序列。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1～2所述的sgrna或如权利要求5～6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas蛋白或cas蛋白的表达载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括如权利要求1～2所述的sgrna、或如权利要求5～6所述的重组载体，以及药学上可接受的载体。
10.一种在细胞中提高人hla-a基因的敲除或敲降效率的方法，其特征在于，包括：
