本申请涉及一种利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法及培养基，属于生物技术和基因。
背景技术：
1、人血清白蛋白（human serum albumin，hsa）是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的50~60%，hsa属于一种单链无糖基化蛋白质，组成为585个氨基酸，分子量是66.5kd，等电点介于4.7~4.9，分子中含17对二硫键和1个自由巯基，整个分子盘旋成心型。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时维持血液正常的渗透压。
2、在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。人血清白蛋白主要从血浆中提取，由于血浆来源有限，加上血液传播的疾病如艾滋病、肝炎等的威胁，使得人们对应用血浆中提取的血清白蛋白作为医药用途产生了巨大的担忧。
3、重组蛋白药物是应用基因工程技术产生的蛋白质药物，近年来重组蛋白药物已经成为生物药物的重要组成部分。重组蛋白药物的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达、酵母蛋白表达、昆虫细胞蛋白表达及哺乳动物细胞蛋白表达，目前已经有人在大肠杆菌、酵母、动物细胞和水稻来表达生产人血清白蛋白。
4、high five（正式名称为bti-tn-5b1-4）是一种昆虫细胞系，起源于粉纹夜蛾的卵巢细胞，是由美国的植物研究所bti发现的，high five细胞使用杆状病毒或转染，且比sf9细胞等鳞翅类昆虫细胞系表达更多的重组蛋白，它们可以在没有血清的情况下生长，并且可以以松散的附着状态或悬浊液培养。
5、昆虫细胞表达蛋白具有良好的表达水平和相对较快的生长速度，并且蛋白的糖基化修饰更接近哺乳动物细胞，杆状病毒将在昆虫宿主细胞中扩增，产生的重组蛋白在后转录后修饰方面与哺乳动物细胞表达的蛋白更加类似，其表达的产物在分子结构、物理化学性质和生物功能方面与人血清白蛋白更接近，因此表达产物具有强大的生物活性，并且其相比哺乳动物细胞表达白蛋白，具有更低的培养基成本和更简单的生长要求，更加适合工业化生产，因此研究昆虫细胞表达人白蛋白具有重要的意义，而目前尚未见到利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的报道。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，提供了一种利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法及培养基，本申请方案中针对bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白进行密码子优化，并且筛选表达效率较高的信号肽序列，并且通过对基础昆虫培养基进行优化，明显提高了利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的效率。
2、根据本申请的一个方面，提供了一种培养bti-tn-5b1-4细胞表达人白蛋白用培养基，所述培养基由昆虫培养基grace’s insect medium，supplemented补加10wt% fbs并添加乙醇胺和胰岛素后获得，所述乙醇胺的添加浓度为6~10μg/ml，胰岛素的添加浓度为3~7μg/ml。
3、根据本申请的另一个方面，提供了一种利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，所述方法包括将编码人白蛋白的核苷酸序列seq id no：5导入bti-tn-5b1-4细胞后，培养所述bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的步骤。
4、可选的，所述方法包括如下步骤：
5、s1、将bti-tn-5b1-4细胞经传代、加入培养基培养该细胞，形成生长良好的细胞单层；
6、s2、利用所述编码人白蛋白的核苷酸序列seq id no：5与载体pfastbacl制备重组载体；
7、s3、重组载体转化e.coli dh5α感受态细胞，然后将获得的重组质粒转化e.colidh10bac感受态细胞，获得重组杆状病毒质粒bacmid；
8、s4、将重组杆状病毒质粒bacmid转染bti-tn-5b1-4细胞，进行悬浮培养。
9、可选的，所述步骤s4中悬浮培养采用上述的培养基。
10、根据本申请的另一个方面，提供了一种编码人白蛋白的游离核苷酸，所述核苷酸的序列如seq id no：5所示。
11、根据本申请的另一个方面，提供了一种含有上述编码人白蛋白的游离核苷酸的表达载体。
12、可选的，所述载体为pfastbacl。
13、根据本申请的另一个方面，提供了一种含有上述编码人白蛋白的游离核苷酸或上述的表达载体的重组bti-tn-5b1-4细胞。
14、根据本申请的另一个方面，提供了利用上述bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法在制备重组人血白蛋白中的应用。
15、本申请的有益效果包括但不限于：
16、1．根据本申请的利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，通过针对bti-tn-5b1-4细胞进行密码子优化，并且针对信号肽进行筛选，发现hbm信号肽能够明显改善人白蛋白在bti-tn-5b1-4细胞中的分泌效果，从而明显提高利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的效率，相比于未优化序列提升高达166%。
17、2．根据本申请的利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，针对培养基进行优化，通过加入乙醇胺和胰岛素能够明显改善bti-tn-5b1-4细胞早期的生长状态，相比于常规使用的tnm-fh完全培养基具有更好的人白蛋白表达效率，提升73%。
18、3．根据本申请的利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，成功实现利用bti-tn-5b1-4细胞中高效表达重组人白蛋白，在分子结构、物理化学性质和生物功能方面与人血清白蛋白更接近的同时，相比哺乳动物细胞表达白蛋白还具有更低的培养基成本和更简单的生长要求，适合工业化生产，具有重要的工业应用前景和经济价值。
1. 一种培养bti-tn-5b1-4细胞表达人白蛋白用培养基，其特征在于，所述培养基由昆虫培养基grace’s insect medium，supplemented补加10wt% fbs并添加乙醇胺和胰岛素后获得，所述乙醇胺的添加浓度为6~10μg/ml，胰岛素的添加浓度为3~7μg/ml。
2. 一种利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括将编码人白蛋白的核苷酸序列seq id no：5导入bti-tn-5b1-4细胞后，培养所述bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的步骤。
3.根据权利要求2所述的利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的利用bti-tn-5b1-4细胞表达重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤s4中悬浮培养采用如权利要求1中所述的培养基。
5. 一种编码人白蛋白的游离核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如seq id no：5所示。
6.一种含有权利要求5所述编码人白蛋白的游离核苷酸的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pfastbacl。
8.一种含有权利要求5所述编码人白蛋白的游离核苷酸或权利要求6或7所述的表达载体的重组bti-tn-5b1-4细胞。
9.如权利要求8所述的重组bti-tn-5b1-4细胞在生产人白蛋白中的应用。
