本发明属于药物检测，具体涉及一种独一味胶囊的检测方法、构建独一味胶囊对照指纹图谱的方法、独一味胶囊质量控制方法和检测独一味样品中特征成分的方法。
背景技术：
1、《中药注册管理专门规定》中指出，中药新药研制应当注重体现中医药原创思维及整体观，主要注册标准的研究、制定应当尽可能反映产品的质量状况，并关注与中药有效性、安全性的关联。且支持运用新技术、新方法探索建立制剂质量控制的指纹图谱或者特征图谱、生物效应检测等。中药指纹图谱是一种综合的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
2、中药指纹图谱能基本反映中药质量特征、体现品种特点，且方法应科学可行并兼顾简便、易行、经济、环保等要求；中药指纹图谱同特征图谱相同，对于识别中药制剂关键质量属性，研究量质传递，评价中药制剂质量的均一性、稳定性，提高中药制剂整体质量控制水平具有重要意义。
3、独一味胶囊为康县独一味生物制药有限公司独家品种，收载于2020年版《中国药典》，批准文号为国药准字z10970053。该药品品种为单方制剂，具有活血止痛，化瘀止血的作用。用于多种外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折，筋骨扭伤，风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙龈肿痛、出血。此外，研究显示独一味药材还具有抗菌、抗炎、免疫调节、抗肿瘤的作用（李季文,毕映燕,李俊江.独一味化学成分和药理作用的研究进展及其质量标志物预测分析[j].中国现代中药,2024,26(05):903-911.），独一味药材中各类抗炎成分还可协同增效（康点点,张蓉蓉,詹琥珀,等.基于网络药理学和组分结构理论探讨独一味抗炎有效成分的协同作用与配伍结构[j].中国中药杂志,2024,49(13):3505-3514.）；独一味胶囊生产工艺很好的继承并保留了独一味药材中的各类有效成分。为提升独一味胶囊质量标准、保障药品质量可控，亟需建立独一味胶囊指纹图谱，用于独一味胶囊成品制剂质量的控制。
4、文献（hplc特征图谱结合化学计量学评价独一味药材及其与独一味胶囊的一致性，天然产物研究与开发，nat prod res dev 2018,30:251-256）采用10批独一味药材与11批独一味胶囊分别测定了指纹图谱，其采用的色谱条件为：以kromasil100-5 c18 柱 (4.6mm × 250 mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.4%磷酸溶液为流动相b，按表1的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为35℃；检测波长为235nm。其供试品溶液的制备方法为：取独一味药材或独一味胶囊细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇25ml，称定重量，回流60min，放冷后补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜即可。
5、
6、但是，上述文献报道的构建独一味胶囊指纹图谱的方法存在以下问题：
7、1、按照该文献记载的色谱条件，以独一味胶囊为供试品重复实验，根本无法有效出峰（色谱图如图1所示）。
8、2、该文献报道的独一味胶囊指纹图谱中，没有指认出绿原酸、隐绿原酸和异毛蕊花糖苷。这三种成分中绿原酸是独一味胶囊中止血、镇痛、抗炎的一种活性成分，隐绿原酸更是具有活血化瘀、抗菌、消炎的药理作用，而异毛蕊花糖苷与毛蕊花糖苷相同，均属独一味胶囊中的苯乙醇苷类成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物、神经保护的作用。这三种化学成分的指认对独一味胶囊组分信息的表征具有重要作用。
9、3、该文献报道的构建独一味胶囊指纹图谱的方法中无法充分分离山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸吸收峰。
10、4、该文献报道的构建独一味胶囊指纹图谱的方法耐用性差，专属性差，不能用于独一味胶囊质量控制。
11、5、该文献采用的独一味胶囊未完全包含康县独一味生物制药有限公司生产的独一味胶囊的所有原料药产地，用该文献报道的独一味胶囊指纹图谱作为对照指纹图谱来评价评价康县独一味生物制药有限公司的独一味胶囊不具备代表性。
12、6、该文献报道的供试品溶液制备方法存在过滤较困难，操作繁杂的问题。
技术实现思路
1、为了克服现有技术存在的上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种独一味胶囊的检测方法，第二个目的在于提供一种构建独一味胶囊对照指纹图谱的方法，第三个目的在于提供一种独一味胶囊的质量控制方法，第四个目的在于提供一种检测独一味样品中特征成分的方法。
2、本发明提供了一种独一味胶囊指纹图谱的检测方法，所述方法包括以下步骤：
3、（1）供试品溶液的制备：取独一味胶囊内容物，加溶剂提取，即得；
4、（2）吸取供试品溶液，注入液相色谱仪中，进行检测，记录色谱图；检测的色谱条件如下：
5、色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
6、流动相：由a相b相组成，其中，a相为乙腈，b相为0.05%-0.2%磷酸水溶液。
7、进一步地，步骤（1）中，所述溶剂为甲醇、甲醇水溶液、乙醇或乙醇水溶液；所述提取的方式为加热回流提取或超声提取，所述提取的时间为60-90分钟。
8、进一步地，步骤（1）中，所述溶剂为70%甲醇水溶液。
9、进一步地，步骤（2）中，所述色谱条件中，色谱柱为alletch leader c18、月旭xbc18、kromasil 100-5-c18、中谱红rd-c18、菲罗门luna或agilent sb c18；
10、b相为0.1%磷酸水溶液；
11、检测波长为230-240nm，柱温为30℃±5℃，流速为0.9-1.1ml/min。
12、进一步地，步骤（2）中，所述色谱条件中，检测波长为235nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
13、进一步地，所述流动相的洗脱条件为：
14、
15、本发明还提供了一种构建独一味胶囊对照指纹图谱的方法，所述方法包括以下步骤：利用前文所述的检测方法检测独一味胶囊，将记录的色谱图合并生成独一味胶囊对照指纹图谱。
16、根据《中药制剂特征图谱研究技术指导原则》（试行）中“特征图谱的建立”规定：“特征图谱应当具有足够的代表性，应当能反映多组份信息，表征中药的质量特征。一般应当根据15批及以上代表性样品的测定结果研究制定。”
17、进一步地，所述独一味胶囊的批次为15批以上。
18、本发明中 ，“15批以上”指15批或大于15批。
19、进一步地，所述独一味胶囊是以独一味药材为单一药物制备而成的单方制剂。
20、进一步地，所述独一味胶囊产自康县独一味生物制药有限公司。
21、进一步地，所述独一味胶囊对照指纹图谱是将记录的色谱图利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统合并生成的。
22、进一步地，所述方法还包括以下步骤：取山栀苷甲酯对照品、8-o-乙酰山栀苷甲酯对照品，加溶剂溶解，得参照物溶液；吸取参照物溶液，注入液相色谱仪中，进行检测。
23、进一步地，所述溶剂为醇类溶剂，优选为甲醇。
24、本发明还提供了一种独一味胶囊的质量控制方法，所述方法包括以下步骤：（i）取独一味胶囊，利用前文所述的检测方法检测，记录色谱图；
25、（ii）将记录的色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，相似度不得低于0.90；所述对照指纹图谱是利用前文所述的方法构建得到的。
26、进一步地，步骤（ii）中，所述相似度评价是利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行的。
27、进一步地，步骤（ii）中，所述相似度评价针对的流出时间范围为5-80分钟。
28、本发明还提供了另一种独一味胶囊的质量控制方法，所述方法包括以下步骤：①取独一味胶囊，利用前文所述的检测方法检测，记录色谱图；
29、②取山栀苷甲酯对照品、8-o-乙酰山栀苷甲酯对照品，加溶剂溶解，得参照物溶液；吸取参照物溶液，注入液相色谱仪中，按照前文所述的色谱条件检测；
30、③进行色谱峰比对，步骤①记录的色谱图应呈现与山栀苷甲酯、8-o-乙酰山栀苷甲酯参照物色谱峰保留时间相对应的色谱峰。
31、本发明还提供了另一种独一味胶囊的质量控制方法，所述方法包括以下步骤：（a）取独一味胶囊，利用前文所述的检测方法检测，记录色谱图；
32、（b）取山栀苷甲酯对照品、8-o-乙酰山栀苷甲酯对照品，加溶剂溶解，得参照物溶液；吸取参照物溶液，注入液相色谱仪中，按照前文所述的色谱条件检测；
33、（c）将步骤（a）记录的色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，相似度不得低于0.90，且步骤（a）记录的色谱图应呈现与山栀苷甲酯、8-o-乙酰山栀苷甲酯参照物色谱峰保留时间相对应的色谱峰；所述对照指纹图谱是利用前文所述的方法构建得到的。
34、进一步地，步骤（c）中，所述相似度评价是利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行的。
35、进一步地，步骤（c）中，所述相似度评价针对的流出时间范围为5-80分钟。
36、本发明中，“质量控制方法”指利用该方法对样品进行质控，若满足条件，则符合控制要求。
37、本发明还提供了一种检测独一味样品中特征成分的方法，所述方法包括以下步骤：
38、（a）供试品溶液的制备：取独一味样品，加溶剂提取，即得；所述独一味样品为独一味药材、独一味胶囊中间体和/或独一味胶囊；
39、（b）参照物溶液的制备：取参照物，加溶剂溶解，即得；所述参照物为特征成分，包括绿原酸、隐绿原酸、异毛蕊花糖苷中的一种以上；
40、（c）分别吸取供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪中，按照前文所述的色谱条件检测独一味样品中的特征成分。
41、本发明中，“一种以上”指一种或大于一种。
42、进一步地，所述特征成分为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、隐绿原酸、8-o-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷b、木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷。
43、本发明还提供了上述检测独一味样品中特征成分的方法在独一味药材、独一味胶囊中间体和独一味胶囊的质量控制中的用途。
44、本发明中，醇类溶剂包括醇和醇的水溶液。
45、本发明中，磷酸溶液即指磷酸水溶液，甲醇溶液指甲醇水溶液，乙醇溶液指乙醇水溶液。如无特别说明，溶液的浓度指体积浓度。
46、本发明取得了以下有益效果：
47、本发明提供了一种独一味胶囊的检测方法，该检测方法可以充分分离独一味胶囊的组分。
48、利用该检测方法，可以进一步构建独一味胶囊对照指纹图谱，对独一味胶囊进行多成分指征并进行相似度评价，较现有技术效果，能够更充分、更全面的反应独一味胶囊中的组分信息。
49、在本发明的申请日以前，独一味胶囊注册标准中收载的项目除制剂常规检查项以外，另有性状及薄层色谱鉴别1项，含量测定2项（即uv法测定总黄酮含量及hplc法测定山栀苷甲酯和8-o-乙酰山栀苷甲酯的总量），为了能够更充分、更全面的反映独一味胶囊中的组份信息，本发明提供了一种建立独一味胶囊指纹图谱的方法，有利于提高该品种整体质量的控制水平，确保产品质量的稳定性和均一性。本发明首次建立了独属于独一味胶囊的指纹图谱构建方法，进一步提高并完善了药品的质量控制标准。
50、利用本发明的检测方法，在同一色谱条件下检测每批次独一味胶囊，并与对照指纹图谱进行对比，结合指纹图谱的相似度评价批与批之间的质量一致性，进一步保障药品的质量可控性、提高药品整体质量控制水平。
51、利用本发明方法构建的指纹图谱，尽可能指认出了独一味药材及制剂的各组分化合物峰，有效达成“中药指纹图谱能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价”要求。
52、利用本发明的检测方法，从成品制剂出发，建立了专属于独一味胶囊指纹图谱检测的色谱方法，注重并体现了中医药的整体观，可反映中药质量特征、体现品种特点。
53、本发明指纹图谱方法建立过程中，采用了质谱方法进行研究，充分分析了独一味胶囊中的化学成分并进行了指认，较现有技术多指认出了绿原酸、隐绿原酸、异毛蕊花糖苷等化合物成分，使质量控制更准确，为后续独一味药材及制剂的研究进一步奠定基础，可有效反映独一味胶囊生产工艺有效的继承并保留了药材的有效成分及药理作用。
54、利用本发明检测方法构建的指纹图谱充分分离了山栀苷甲酯、绿原酸和咖啡酸。
55、利用本发明的检测方法，还可以检测独一味药材、制剂中间体（浸膏粉、颗粒）和成品制剂中的特征成分（包括胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、隐绿原酸、8-o-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷b、木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷），增加监控独一味胶囊中间产品及成品质量控制手段。
56、在本发明的检测方法中，供试品溶液的制备方法采用的供试品量比现有技术明显减少，溶液过滤更简单，溶液制备方法同2020年版《中国药典》独一味胶囊质量标准【含量测定】项下“山栀苷甲酯、8-o-乙酰山栀苷甲酯”测定项下相同，可共用，节约了检测成本，进一步减少了环境污染的可能性。
57、较现有技术的方法，本发明的检测方法操作简单，精密度及重复性良好，专属性、系统适用性及方法耐用性更好。
58、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
59、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
1.一种独一味胶囊的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溶剂为甲醇、甲醇水溶液、乙醇或乙醇水溶液；所述提取的方式为加热回流提取或超声提取，所述提取的时间为60-90分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溶剂为70%甲醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述色谱条件中，色谱柱为alletch leader c18、月旭xb c18、kromasil 100-5-c18、中谱红rd-c18、菲罗门luna或agilent sb c18；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述色谱条件中，检测波长为235nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
6.一种构建独一味胶囊对照指纹图谱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用权利要求1-5任一项所述的检测方法检测独一味胶囊，将记录的色谱图合并生成独一味胶囊对照指纹图谱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述独一味胶囊的批次为15批以上。
8.一种独一味胶囊的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（i）取独一味胶囊，利用权利要求1-5任一项所述的检测方法检测，记录色谱图；
9.一种独一味胶囊的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：①取独一味胶囊，利用权利要求1-5任一项所述的检测方法检测，记录色谱图；
10.一种独一味胶囊的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（a）取独一味胶囊，利用权利要求1-5任一项所述的检测方法检测，记录色谱图；
11.一种检测独一味样品中特征成分的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述特征成分为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、隐绿原酸、8-o-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷b、木犀草苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷。
