本发明属于分子诊断，具体涉及一种核酸适配体及其修饰温启动逆转录酶的应用和产品。
背景技术：
1、在分子诊断领域，目前用于核酸扩增的主要手段仍然是pcr技术。在pcr过程中，用于识别核酸扩增信号的方法主要有两类，一类是利用与靶向核酸序列特异性结合的荧光探针（例如taqman探针），在解离过程中释放出荧光信号来表示核酸扩增结果，另一类是通过与双链扩增产物非特异结合的荧光染料（例如sybr）释放的荧光信号来表示，前者更适用于特定疾病的核酸检测。
2、在核酸检测中，针对dna样本，为了提高体系的特异性和灵敏度，大家普遍选择针对taq dna聚合酶的聚合酶活性进行活性封闭，即热启动（taq dna聚合酶热激活之前不表现聚合酶活性），使其在热激活之前不工作也就不会产生引物二聚体等非特异扩增。而rna样本扩增时，多了一步逆转录的过程，rna扩增也额外多需求一个逆转录酶，而逆转录酶由于其耐热性没有taq dna聚合酶那样高，无法采用同样的活性封闭方式。这样在低温存储试剂时体系中引物在逆转录酶作用下会缓慢发生非特异扩增，即引物二聚体，引物二聚体也会进行pcr扩增，它的存在会消耗pcr体系中的原料，所以当靶核酸的原浓度较低时，会因为引物二聚体的竞争作用而使得扩增结果较差，表现在扩增曲线形态差、荧光增量低等方面，这会大大降低pcr扩增体系的灵敏度和特异性。
3、在商品化pcr扩增产品中，大部分厂商会选择加入taq酶抗体来封闭低温下taq酶的活性，从而避免taq酶在低温下刺激产生引物二聚。而在pcr扩增的变性阶段，taq酶抗体会失活从而失去封闭taq酶活性的功能，本领域称之为taq酶的热启动。但是由于逆转录酶工作的环境温度不高（50℃左右），逆转录酶抗体是无法在这个温度下失活的，这样也导致了市面上很少有在低温下封闭逆转录酶活性的商品化原料，逆转录酶热启动也就成为了一个技术难题。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种核酸适配体及其修饰温启动逆转录酶的应用和产品。本发明提供了特异性结合逆转录酶的核酸适配体，具有如seq id no.38-45所示的任意一种或多种核苷酸序列，其生产周期短技术成熟，适用于大规模商业生产。核酸适配体结合逆转录酶后，逆转录酶的低温活性被封闭，使37℃外切活性封闭率98%以上，启动温度达37℃以上。通过抑制低温储存时产生二级结构，使反应液能长期持续稳定高效地获得逆转录产物，解决了全预混液储存稳定性的难题。制备得到的试剂盒特异性好，亲和力强，灵敏度高，反应速度快，经济成本低，结果重复性好，数据精准客观可靠。
2、术语：
3、本发明中所述的“pho”代表：磷酸化修饰。
4、本发明中所述的“ddc”代表：双脱氧修饰。
5、本发明中所述的“warm-start m-mlv reverse transcriptase(ⅲ)”是经过同科特殊开发的适配体修饰的同科基因工程改造的逆转录酶。可以做到37℃以下无逆转录活性，55℃即可完全释放逆转录活性且不影响cdna合成以及后续qpcr。解决了rt-qpcr 反应在室温配制反应过程rt酶容易产生引物二聚体的问题，提供了更高的体系特异性，同时还能保持原有逆转录酶特性。可根据需要选用 oligo dt、随机引物或者特异性引物作为逆转录引物，得到的 cdna 可用于后续的pcr、qpcr 检测、cdna文库构建等。对于一管式全预混rt-qpcr mix 开发提供有力的支持。单位定义：一活力单位的warm-start m-mlv reversetranscriptase(ⅲ)是指在37℃条件下，10 分钟内催化1nmol dntp 结合到噬菌体ms2 上形成 ms2 rna/dna复合物所需的酶量为一个单位。
6、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7、第一方面，本发明提供了一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，所述的核酸适配体具有如seq id no.38-45所示的任意一种或多种核苷酸序列。
8、具体地，所述的所述的核酸适配体具有如seq id no.38、seq id no.39、seq idno.40、seq id no.41、seq id no.42、seq id no.43、seq id no.44和/或seq id no.45所示的核苷酸序列。
9、进一步具体地，所述的核酸适配体具有如seq id no.40和/或seq id no.43所示的核苷酸序列。
10、优选地，所述的核酸适配体为具有如seq id no.40所示的核苷酸序列。
11、具体地，所述的核酸适配体的核苷酸序列上的3'端碱基被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、双脱氧或巯基化。
12、具体地，所述的逆转录酶具有如seq id no.59所示的氨基酸序列。
13、优选地，所述的逆转录酶的制备方法包括：
14、s1、使用同源重组的方法，把包含逆转录酶突变体基因序列的dna片段（seq idno.60）与线性化的pet28a载体进行化学转化得到重组质粒。重组质粒转入e. colibl21感受态进行培养后挑取单菌落进行菌落pcr筛选阳性转化子，保菌，即制备出的含有逆转录酶突变体的重组菌株。
15、s2、逆转录酶突变体经过粗酶提取蛋白纯化，即制备出逆转录酶。
16、第二方面，本发明提供了一种上述的核酸适配体在修饰逆转录酶中的应用。
17、具体地，所述的应用包括：将核酸适配体与逆转录酶混合，孵育后得到温启动逆转录酶。
18、进一步具体地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：5-20μm。
19、优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：5-10μm、10u：10-15μm或10u：15-20μm。
20、进一步优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：15-20μm。
21、再进一步优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：20μm。
22、具体地，所述的孵育条件为：20-30℃孵育1-3h。
23、优选地，所述的孵育条件为：25℃孵育2h。
24、第三方面，本发明提供了一种温启动逆转录酶，所述的温启动逆转录酶包括：将逆转录酶与上述的核酸适配体混合，孵育后得到温启动逆转录酶。
25、具体地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：5-20μm。
26、优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：5-10μm、10u：10-15μm或10u：15-20μm。
27、进一步优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：15-20μm。
28、再进一步优选地，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：20μm。
29、具体地，所述的孵育条件为：20-30℃孵育1-3h。
30、优选地，所述的孵育条件为：25℃孵育2h。
31、第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括上述的核酸适配体或上述的温启动逆转录酶。
32、具体地，所述的试剂盒用于：病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。
33、具体地，所述的试剂盒还包括：pcr用水、逆转录反应缓冲液、dntp、逆转录反应引物中的一种或多种。
34、第五方面，本发明提供了上述的核酸适配体、温启动逆转录酶或试剂盒在检测核酸中的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。
35、优选地，所述的核酸包括dna和/或rna。
36、优选地，所述的核酸适配体、温启动逆转录酶或试剂盒用于检测动物、植物和/或微生物核酸中的应用。
37、本发明具有以下有益效果：
38、（1）经过本发明提供的核酸适配体修饰后的逆转录酶低温活性被封闭，启动温度可达37℃以上，解决了rt-pcr、rt-qpcr、cdna合成等试剂盒全预混液储存稳定性的难题，通过抑制低温储存时产生二级结构，使反应液能长期持续稳定高效地获得逆转录产物。
39、（2）本发明提供的核酸适配体制备得到的温启动逆转录酶和试剂盒特异性好，亲和力强，灵敏度高，反应速度快，经济成本低，结果重复性好，数据精准客观可靠。
1.一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体具有如seqid no.38-45所示的任意一种或多种核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷酸序列上的3'端碱基被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、双脱氧或巯基化。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述的逆转录酶具有如seq idno.59所示的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体在修饰逆转录酶中的应用。
5.一种温启动逆转录酶，其特征在于，所述的温启动逆转录酶包括：将逆转录酶与权利要求1-3任一项所述的核酸适配体混合，孵育后得到温启动逆转录酶。
6.根据权利要求5所述的温启动逆转录酶，其特征在于，所述的逆转录酶与核酸适配体的混合比例为10u：5-20μm。
7.根据权利要求5所述的温启动逆转录酶，其特征在于，所述的孵育条件为：20-30℃孵育1-3h。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的核酸适配体或权利要求5-7任一项所述的温启动逆转录酶。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于：病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。
10.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求5-7任一项所述的温启动逆转录酶或权利要求8所述的试剂盒在检测核酸中的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。
