本公开涉及核酸的，具体涉及与基因活化相关联的寡核苷酸调节剂及其药物应用。
背景技术：
1、杜氏肌营养不良症(dmd)是一种隐性、x连锁遗传疾病，其发生频率为约3500至5000名男性新生儿之一。全球每年约有20000名儿童被诊断患有dmd。dmd导致患者在生命的第2-4个十年过早死亡。这种疾病是由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的dmd基因突变引起的，该蛋白质在肌肉纤维中很重要，它的缺失会导致肌肉无力，其随着时间的推移会变得更糟，因为肌肉细胞会崩解并逐渐丢失。约1/3的儿童由于抗肌萎缩蛋白基因的自发突变而罹患dmd，并且没有该疾病家族史。
2、抗肌萎缩蛋白是抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(dgc)的部分，它桥接了内部细胞骨架(f-肌动蛋白)和细胞外基质。以这种方式，它在收缩期间使肌肉纤维具有稳定性。贝克尔肌营养不良症(bmd)是一种较温和，进展性较低的疾病形式，也是由同一dmd基因的变化引起的。
3、一般而言，dmd患者携带的突变会产生不完全的抗肌萎缩蛋白(无义或移码突变)，这是无功能的，而在bmd中，表达分子量较低的内部缺失蛋白(衍生自框内缺失)，其具有部分功能性。
4、dmd基因高度复杂，包含至少七个独立的组织特异性启动子和两个聚腺苷酸化位点。此外，抗肌萎缩蛋白转录本是交替剪接的，产生一系列不同的转录本，编码大量蛋白质同种型。抗肌萎缩蛋白也在脑中表达，其在脑中的功能尚不为人知。然而，脑部抗肌萎缩蛋白的缺乏可能是许多dmd患者经历的认知问题的因素。
5、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)基因(utrn)编码抗肌萎缩蛋白相关蛋白，其与抗肌萎缩蛋白共有结构和功能相似性。抗肌萎缩蛋白相关蛋白包含肌动蛋白结合性n末端，三卷曲螺旋重复中心区域和由蛋白质-蛋白质相互作用基序组成的c末端，该基序能与肌养蛋白聚糖(dystroglycan)蛋白质组分相互作用。抗肌萎缩蛋白相关蛋白位于神经肌肉突触和肌腱接合处，它在那里参与突触后膜维持和乙酰胆碱受体聚簇。
6、在早期人类肌肉发育中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白出现于肌膜处，并逐渐被抗肌萎缩蛋白取代至出生。在成人组织中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白在肺、肾、肝、脾等多种组织中表达，不仅局限于肌肉中的神经肌肉和肌腱接合处，还出现于再生肌纤维和血管的肌膜中。据报道，两种抗肌萎缩蛋白相关蛋白启动子a和b受差异性调节以驱动两种不同的mrna同种型翻译成具有独特n末端和不同表达模式的全长抗肌萎缩蛋白相关蛋白。
7、与抗肌萎缩蛋白组织特异性启动子不同，驱动编码全长蛋白的基因的抗肌萎缩蛋白相关蛋白a启动子与基因5'端的cpg岛相关联。在许多组织中表达的抗肌萎缩蛋白相关蛋白a是在神经肌肉和肌腱连接处、脉络丛、软脑膜和肾小球的肌肉中表达的同种型，并且出现于再生肌纤维的肌膜中。与抗肌萎缩蛋白相关蛋白a的区别在于n末端作用结合位点略有不同的抗肌萎缩蛋白相关蛋白b，仅限于内皮细胞和血管。抗肌萎缩蛋白和抗肌萎缩蛋白相关蛋白都有由类似的内部启动子(dp71，dp140，up71，up140)驱动的较小的转录本。
8、抗肌萎缩蛋白相关蛋白是抗肌萎缩蛋白的常染色体和功能类似物，且能够补偿抗肌萎缩蛋白在dmd和bmd中的原发性缺陷。小鼠研究表明，抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因可作为抗肌萎缩蛋白基因的功能替代物，因此可作为抗肌萎缩蛋白缺乏引起的肌肉萎缩症的潜在治疗靶标。因此，基于抗肌萎缩蛋白相关蛋白的策略有可能为所有dmd/bmd患者(无论其遗传缺陷如何)提供治疗。
9、利用寡核苷酸诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白的转录和转录后水平表达，对于开发dmd和bmd(无论dmd基因中突变的位置)的新疗法而言，都是一种有吸引力的方法。然而，这种方法受到基因上调工具的限制[us20120122953a1和wo2019183005a1]。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本公开提供了一种寡核苷酸调节剂，例如小活化rna(sarna)分子，用于通过靶向utrn基因启动子并随后活化utrn基因转录并提高抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达水平以通过rna活化(rnaa)机制补偿抗肌萎缩蛋白缺陷，来治疗由缺乏抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白水平不足引起的疾病或病症(如dmd和bmd)。
2、具体地，发明人发现，这种能够活化/上调utrn mrna表达的sarna不随机分布在启动子上，而是簇集在某些特定的热点区域。只有utrn基因的启动子上的一些区域有利于sarna的基因活化，例如utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496、-351至-294、-236至-187和-101至-65。发明人还发现，utrn启动子区域内sarna的最佳靶序列/正义链包括具有以下标准的序列：(1)gc含量在35％至70％之间；(2)少于5个连续相同核苷酸；(3)3个或更少二核苷酸重复；和(4)3个或更少三核苷酸重复。作为该标准的有益结果，靶序列(例如，包含靶序列的分离的核酸序列)在与sarna相互作用时，与utrn mrna的基线水平相比，能使utrn mrna的表达活化/上调至少10％。至少部分基于这些发现，本公开内容的特征是sarna、组合物和药物组合物，其用于使utrn mrna的表达活化/上调至少10％(与utrn基因的基线水平相比)。本文还提供了用于预防或治疗个体中由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或低功能性抗肌萎缩蛋白水平引起的疾病或病症的方法，包括给予本文所述的sarna、组合物和/或药物组合物之任一者。
3、在本公开内容的一个方面，提供了一种能够活化/上调细胞中utrn基因表达的寡核苷酸调节剂(例如sarna分子)，该寡核苷酸调节剂(例如sarna)包含长度为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述连续寡核苷酸序列与seq id no:1200的等长区域具有至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％的序列同源性或互补性，由此与utrn基因的基线表达相比使基因的表达活化或上调至少10％。在一些实施方式中，seq id no:1200的等长区域位于utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496(seq id no:1207)、区域-351至-294(seq id no:1208)、区域-236至-187(seq id no:1209)或区域-101至-65(seq idno:1210)。
4、在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna包括正义链和反义链，其中正义链和反义链各自包含互补区域，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链具有至少90％的互补性。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链位于两条不同的核酸链上。而在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链位于连续的核酸链(任选地为发夹式单链核酸分子)上，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链包括长度为0至6个核苷酸，或者长度为2至3个核苷酸的3'突出端。在某些实施方式中，突出端的核苷酸中至少一个是胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，突出端是天然的突出端，它们是选自或互补于dna靶标上相应位置的核苷酸。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链独立地包含约16至约35、约17至约30、约18至约25、或约19至约22个连续核苷酸的长度。
5、在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链与选自seq id no:400-797的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性，并且本公开内容公开的反义链与选自seq id no:800-1197的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链包括选自seq id no:400-797的核苷酸序列，而本公开内容公开的反义链包括选自seqid no:800-1197的核苷酸序列。
6、在某些实施方式中，本公开内容公开的寡核苷酸序列与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性或互补性。在某些实施方式中，本公开内容公开的寡核苷酸序列的正义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。在某些实施方式中，本公开内容公开的寡核苷酸序列的反义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列互补性。
7、在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna的至少一个核苷酸是经化学修饰的核苷酸。在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna的反义和/或正义链的至少一个核苷酸经化学修饰。在某些实施方式中，本公开内容公开的经化学修饰核苷酸是具有至少一种以下修饰的核苷酸：
8、a)对于连接sarna核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
9、b)对于sarna的核苷酸序列中核糖的2'-oh的修饰；和
10、c)对于sarna的核苷酸序列中的碱基的修饰。
11、在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna的至少一个核苷酸是锁核酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、亚磷酰胺或包含非天然碱基的核苷酸。
12、在某些实施方式中，本公开内容公开的至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在正义链或反义链的5'端添加(e)-乙烯基膦酸酯部分。
13、在某些实施方式中，本公开内容提供了寡核苷酸调节剂，其中，本公开内容公开的sarna的正义链和/或反义链与选自脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体的一种或多种偶联部分偶联。
14、在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna的正义链或反义链与选自细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和n-乙酰半乳糖胺的一种或多种偶联部分偶联。
15、在所述寡核苷酸调节剂的某些实施方式中，本公开内容公开的sarna的正义链或反义链与选自细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和n-乙酰半乳糖胺的一种或多种偶联部分偶联。
16、在本公开内容的另一方面，提供了一种sarna的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是具有seq id no:1200中16至35个核苷酸的长度的连续核苷酸序列。具体地，分离的多核苷酸是选自seq id no:1-398的核酸序列。在本公开内容的另一方面，提供了使用sarna的分离的多核苷酸的方法。
17、在本公开内容的另一方面，提供了一种分离的寡核苷酸复合物，其中所述分离的寡核苷酸复合物包含本文公开的sarna的反义链和本文公开的分离的多核苷酸的正义链。在某些实施方式中，与utrn基因的基线水平相比，分离的寡核苷酸复合物使该基因的表达活化至少10％。
18、本公开内容的另一方面提供了编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸。在一个实施方式中，本文公开的sarna是小活化rna(sarna)分子。在一个实施方式中，多核苷酸是dna分子。本公开内容的另一方面提供了包含本文公开的分离的多核苷酸的载体。
19、在本公开内容的另一方面，提供了一种分离的核酸复合物，其中所述分离的核酸复合物包含本文公开的sarna的反义链和本文公开的分离的多核苷酸的正义链。在某些实施方式中，与utrn基因在细胞中的基线表达相比，分离的核酸复合物使utrn基因的表达活化至少10％。
20、本公开还涉及编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸。还公开了包含本文公开的分离的多核苷酸的载体。
21、本公开内容的另一方面提供了一种细胞，包括本文公开的sarna、编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸或本文公开的载体。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，任选地人细胞。在一些实施方式中，细胞是宿主细胞。前述细胞可以是体外的，例如细胞系或细胞株，或者可以存在于哺乳动物体内，例如人体。在某些实施方式中，分离的多核苷酸是dna。在某些实施方式中，载体是aav。
22、本公开内容的另一方面提供了一种组合物，例如药物组合物，其包含前述sarna或编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸，和任选的药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，药学上可接受的运载体包括水性运载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。在一些实施方式中，药学上可接受的运载体选自水性运载体、脂质体、高分子聚合物和多肽。在某些实施方式中，水性运载体可以是例如无rna酶的水或不含rna酶的缓冲液。在一些实施方式中，组合物可包含0.001-200nm(例如，0.001-200nm、0.001-100nm、0.001-50nm、0.001-20nm、10-100nm、10-50nm、20-50nm、20-100nm或50-150nm)，或任选地1～150nm的上述sarna或编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸。
23、本公开内容的另一方面涉及前述sarna、编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸或包含前述sarna或本文公开的分离的多核苷酸的组合物在制备用于活化/上调utrn基因在细胞中的表达的制剂中的用途。
24、本公开内容还涉及一种在细胞中活化/上调utrn基因表达的方法，其中所述方法包括向细胞给予前述sarna、本文公开的分离的多核苷酸，或包含前述sarna或本文公开的分离的多核苷酸的组合物。同时，还提供了用于增加细胞中抗肌萎缩蛋白相关蛋白的水平或肌肉中功能性抗肌萎缩蛋白相关蛋白的水平的方法，包括将有效量的本文公开的sarna、核酸或组合物引入细胞。
25、前述的sarna、本文公开的分离的多核苷酸或包含上述sarna或本文公开的分离的多核苷酸的组合物可直接引入细胞，也可在将编码sarna的核苷酸序列引入细胞后在细胞中产生。所述细胞是例如哺乳动物细胞，例如人类细胞。前述细胞可以是体外的，例如细胞系或细胞株，或者可以存在于哺乳动物体内，例如人体。人体可以是患有由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或抗肌萎缩蛋白水平低引起的疾病或症状的对象，并且本文公开的sarna、分离的多核苷酸或包含上述sarna或本文公开的分离的多核苷酸的组合物以足够的量给予，以治疗所述疾病或症状。具体地，由抗肌萎缩蛋白基因突变所致的抗肌萎缩蛋白缺乏和/或功能性抗肌萎缩蛋白表达不足引起的症状包括例如dmd和bmd。在一个实施方式中，由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平引起的疾病是dmd。在另一个实施方式中，由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平引起的疾病是bmd。
26、本公开内容的另一方面涉及用于预防或治疗个体中由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白水平不足引起的病症的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效剂量的本文公开的sarna，编码本文公开的sarna的分离的多核苷酸、本文公开的载体或包含本文公开的sarna的组合物。在某些实施方式中，疾病或病症是dmd。在某些实施方式中，疾病或病症是bmd。个体可以是哺乳动物，例如人类。在一个实施方式中，个体患有由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或肌肉中低功能性抗肌萎缩蛋白水平引起的症状，其可包括例如bmd。在一个实施方式中，由抗肌萎缩蛋白基因突变所致的功能性抗肌萎缩蛋白肌肉水平不足引起的疾病是dmd或bmd。在一个实施方式中，本文描述的疾病包括dmd和bmd。在某些实施方式中，本文公开的sarna、本文公开的分离的多核苷酸、本文公开的载体或本文公开的组合物通过选自以下的一种或多种给予途径给予个体：肠胃外输注、口服给予、鼻内给予、吸入给予、阴道给予和直肠给予。在某些实施方式中，给予途径选自以下的一种或多种：鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、脑室内、玻璃体内和皮下给予。在某些实施方式中，本文公开的方法使utrn基因或utrn mrna在个体中的表达与该基因的基线水平相比活化/上调至少10％(例如，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％)。在某些实施方式中，本文公开的方法使个体中抗肌萎缩蛋白相关蛋白的水平与该基因的基线水平相比增加至少10％。
27、本公开内容的另一方面涉及本文公开的sarna、本文公开的分离的多核苷酸或包含本文公开的sarna或本文公开的分离的多核苷酸的组合物在制备用于预防或治疗个体中由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白水平低引起的病症或病症的药物中的用途。个体可以是哺乳动物，例如人类。在一个实施方式中，疾病或病症可包括例如dmd或bmd。在一个实施方式中，由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平引起的疾病是dmd。在一个实施方式中，本文描述的疾病包括dmd和bmd。
28、此外，本公开还提供了用于进行本文公开的预防或治疗的方法的试剂盒，其中该试剂盒包括：a)sarna，b)使用说明，和c)任选地，用于向个体给予所述sarna的器具。具体地，试剂盒可包装在带标签的包装件中，并且所述包装件上的标签表明所述分子或组合物可用于预防或治疗由抗肌萎缩蛋白表达不足引起的病症或病症，或针对dmd或bmd进行预防或治疗。
29、本公开提供了用于进行本文公开的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含a)本文公开的sarna，和b)使用说明。在某些实施方式中，使用说明包括用于向个体给予本文公开的sarna的器具或方法。
30、本公开内容的多个方面包括试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的sarna、本文公开的分离的多核苷酸、本文公开的载体或本文公开的组合物于带标签的包装件中，并且所述包装件上的标签表明所述sarna、分离的多核苷酸、载体或组合物可用于预防或治疗由抗肌萎缩蛋白表达不足引起的疾病或病症，或针对dmd或bmd进行预防或治疗。
31、本公开内容还提供用于检测肌肉或血浆中，或本文公开的已转染上述sarna、或上述核酸或上述组合物的细胞中的抗肌萎缩蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、或抗肌萎缩蛋白相关蛋白相关蛋白(例如肌养蛋白聚糖(dystroglycan))的试剂盒。
32、本文提供的使utrn基因的表达活化/上调的sarna(如sarna分子)能以低毒性和不良反应来高效且特异性地上调utrn基因的表达并提高utrn mrna的表达水平，且可用于制备用于预防或治疗与抗肌萎缩蛋白表达不足相关联的病症以及由抗肌萎缩蛋白基因突变引起的疾病或病症的药物。
33、附图简要说明
34、图1显示由sarna介导的人utrn mrna表达水平的变化。398个人utrn启动子靶向性sarna以25nm的浓度向人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系(rd)单独转染持续3天。sarna链的序列和双链组成如表1所示。模拟(mock)在没有寡核苷酸的情况下转染(未显示)。dscon2双链体用作非特异性双链体对照(未显示)。ds18-si8是靶向utrn基因的双链体sirna，并转染作为沉默dsrna对照(未显示)。在各pcr反应中使用基因特异性引物集(如表3所示)通过一步rt-qpcr定量第3天的utrn的mrna水平。tbp和b2m的mrna水平的几何平均值用作内参。该值(y轴，log2倍变化)显示在对tbp和b2m进行标准化之后，相对于模拟处理的398个sarna各自对utrn mrna表达水平造成的相对倍数变化(两个重复转染孔的平均值±sem)。sarna根据其诱导utrn mrna表达(log2)的活性在x轴上按降序分选。
35、图2显示了sarna按其在人utrn启动子上的靶位置和热点区域的分选。398个人utrn启动子靶向性sarna以25nm被单独转染进入rd细胞3天。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染(未显示)。dscon2双链体用作非特异性双链体对照(未显示)。ds18-si8是靶向utrn基因的双链体sirna，并转染作为沉默dsrna对照(未显示)。在各个pcr反应中使用基因特异性引物集(如表3所示)通过一步rt-qpcr定量第3天的utrn mrna水平。tbp和b2m的mrna水平的几何平均值用作内参。该值(y轴，log2倍变化)显示在对b2m和tbp进行标准化之后，相对于模拟处理的sarna各自对utrn mrna表达水平造成的相对倍数变化(两个重复转染孔的平均值±sem)。sarna按其在启动子上的位置从utrn转录起始位点(tss)上游-666bp至下游334bp于x轴上分选。4个sarna热点区域的位置在矩形虚线框中标记为h1至h4。方框上方的数字表示相对于utrn tss(+1位置)的热点区域的边界，其跨越各热点区域内第一个sarna靶标的最5'端和最后一个sarna靶标的最3'端。
36、图3显示了前导sarna对人utrn基因rd细胞表达的活化作用。细胞以25nm的sarna浓度处理3天。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dscon2作为非特异性双链体对照转染。ds18-si8是靶向utrn基因的双链体sirna，并转染作为沉默dsrna对照。图3显示了第3天使用基因特异性引物集(如表3所示)通过两步rt-qpcr定量rd细胞中utrn的mrna水平。tbp和b2m的mrna水平的几何平均值用作内参。这些值(y轴)表示为在对tbp和b2m进行标准化之后的相对于模拟处理的utrn mrna表达水平(两个重复转染孔的平均值±sem)。
37、图4显示了前导sarna对rd细胞中utrn的蛋白质表达的活化作用。细胞用指示的sarna(见表1)以25nm处理5天。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dscon2作为非特异性双链体对照转染。ds18-si8是靶向utrn基因的双链体sirna，并转染作为沉默dsrna对照。通过使用针对人抗肌萎缩蛋白相关蛋白的一抗进行western印迹，测定第5天rd细胞中的抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平。针对α/β-微管蛋白的抗体也经印迹以用作蛋白质加载的对照。图4显示通过量化条带强度得出的抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平的相对倍数变化。值(y轴)是抗肌萎缩蛋白相关蛋白对α/β-微管蛋白标准化后的相对条带强度。所有sarna均按其诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达(倍数变化)的活性在x轴上按降序分选。
38、图5显示了sarna对rd细胞中人utrn mrna表达的活化作用。指示的sarna(见表10)以25nm转染至rd细胞中3天。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dscon2作为非特异性双链体对照转染。ds18-si8是靶向utrn基因的双链体sirna，并转染作为沉默dsrna对照。utrn的mrna水平使用基因特异性引物集(如表3所示)通过两步rt-qpcr定量。tbp和hprt1的mrna水平的几何平均值用作内参。这些值(y轴)表示为在对tbp和hprt1进行标准化之后的相对于模拟处理的utrn mrna表达水平(两个重复转染孔的平均值±sem)。
39、图6a-6b显示sarna对rd细胞中人抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达的活化作用。指示的sarna(见表10)以25nm转染至rd细胞中3天。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dscon2作为非特异性双链体对照转染。抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平使用针对人抗肌萎缩蛋白相关蛋白的一抗通过jess测定。针对α/β-微管蛋白的抗体也经检测以用作蛋白质加载的对照。图6a显示抗肌萎缩蛋白相关蛋白和α/β-微管蛋白的蛋白质条带。图6b显示通过量化图6a的条带强度得出的抗肌萎缩蛋白相关蛋白水平的相对倍数变化。值(y轴)是对α/β-微管蛋白进行标准化之后的抗肌萎缩蛋白相关蛋白的相对条带强度(两个重复转染孔的平均±sem)。
1.一种小活化rna(sarna)，其包含长度范围为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列包含与seq id no:1200的等长部分具有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％同源性或互补性的连续核苷酸序列，其中所述sarna使utrn基因的表达相比utrn基因的基线表达上调至少10％。
2.如权利要求1所述的sarna，其中，seq id no:1200的等长部分位于utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496(seq id no:1207)、区域-351至-294(seqid no:1208)、区域-236至-187(seq id no:1209)或区域-101至-65(seq id no:1210)。
3.如权利要求1-2中任一项所述的sarna，其中，所述sarna(1)具有35％至70％的gc含量；(2)具有少于5个连续相同核苷酸；(3)具有3个或更少的二核苷酸重复序列；和(4)具有3个或更少的三核苷酸重复序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的sarna，其中，所述sarna包含正义链和反义链。
5.如权利要求1-4中任一项所述的sarna，其中，所述寡核苷酸序列为所述sarna的正义链或反义链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的sarna，其中正义链和反义链各自包含互补区域，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
7.如权利要求4-6中任一项所述的sarna，其中，所述正义链和反义链具有至少90％的互补性。
8.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链位于两条不同的核酸链上。
9.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链位于连续的核酸链上，任选地为发夹式单链核酸分子，其中所述正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
10.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链至少之一包括长度为0至6个核苷酸的3'突出端。
11.如权利要求10所述的sarna，其中，所述正义链和反义链包含长度为2至3个核苷酸的3'突出端。
12.如权利要求10所述的sarna，其中，所述突出端的核苷酸中至少一个是选自或互补于utrn基因上的相应核苷酸的核苷酸。
13.如权利要求4-12中任一项所述的sarna，其中，所述正义链和反义链独立地包含约16至约35、约17至约30、约18至约25、或约19至约22个连续核苷酸的长度。
14.如权利要求4-12中任一项所述的sarna，其中，所述正义链与选自seq id no:400-797的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性，并且所述反义链与选自seqid no:800-1197的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
15.如权利要求14所述的sarna，其中，所述正义链包含选自seq id no:400-797的核苷酸序列，而所述反义链包含选自seq id no:800-1197的核苷酸序列。
16.如权利要求1所述的sarna，其中，所述寡核苷酸序列与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性或互补性。
17.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
18.如权利要求4所述的sarna，其中，所述反义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列互补性。
19.如权利要求1-18中任一项所述的sarna，其中，所述sarna的至少一个核苷酸是经化学修饰的核苷酸。
20.如权利要求19所述的sarna，其中，所述sarna的反义链和/或正义链的至少一个核苷酸经化学修饰。
21.如权利要求19所述的sarna，其中，经化学修饰的核苷酸是具有以下至少一种修饰的核苷酸：
22.如权利要求19所述的sarna，其中，所述sarna的至少一个核苷酸是锁核酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、亚磷酰胺或包含非天然碱基的核苷酸。
23.如权利要求19所述的sarna，其中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在正义链或反义链的5'端添加(e)-乙烯基膦酸酯部分。
24.如权利要求1-23中任一项所述的sarna，其中，sarna的正义链或反义链与选自脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体的一种或多种偶联部分偶联。
25.如权利要求24所述的sarna，其中，所述sarna的正义链或反义链与选自细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和n-乙酰半乳糖胺及其任意组合的一种或多种偶联部分偶联。
26.一种寡核苷酸调节剂，其包含如权利要求1-25中任一项所述的一种或多种sarna。
27.如权利要求26所述的寡核苷酸调节剂，其还包含与所述sarna偶联、组合或键合的一个或多个部分或组分。
28.如权利要求27所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述sarna的正义链和/或反义链与选自下组的一种或多种偶联部分偶联：脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体。
29.如权利要求27所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述偶联部分各自独立地选自脂质、细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖、n-乙酰半乳糖胺及其任何组合。
30.如权利要求26所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述寡核苷酸调节剂还包含与一个或多个其它活性部分偶联或结合的sarna，以用于utrn相关疾病或病症治疗，其中所述一个或多个其它活性部分各自独立地选自sarna、单链寡核苷酸、化学部分、多肽和抗体。
31.一种分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸包括权利要求1所述的连续核苷酸序列。
32.如权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸是选自seqidno:1-398的核酸序列。
33.一种分离的寡核苷酸复合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna的反义链和权利要求31-32中任一项所述的分离的多核苷酸。
34.如权利要求33所述的分离的寡核苷酸复合物，其中，所述分离的寡核苷酸复合物使utrn基因的表达相对于utrn基因的基线表达活化至少10％。
35.一种分离的核酸序列，其位于utrn基因转录起始位点上游，其中所述分离的核酸序列选自seq id no:1207-1210。
36.如权利要求35所述的分离的核酸序列，其中，所述分离的核酸序列包含权利要求31-32中任一项所述的分离的多核苷酸。
37.如权利要求35所述的分离的核酸序列，其中，靶向分离的核酸序列的设计的sarna中至少25％能使utrn基因的表达活化至少10％，其中所述设计的sarna(1)具有35％至70％的gc含量；(2)具有少于5个连续相同核苷酸；(3)具有3个或更少的二核苷酸重复序列；和(4)具有3个或更少的三核苷酸重复序列。
38.一种分离的核酸复合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna的反义链和权利要求35-37中任一项所述的分离的核酸序列的正义链。
39.如权利要求38所述的分离的核酸复合物，其中，所述分离的核酸复合物使utrn基因的表达相对于utrn基因的基线表达活化至少10％。
40.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-25中任一项所述的sarna。
41.如权利要求40所述的分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸是dna。
42.包含权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸的载体。
43.一种宿主细胞，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸，或权利要求42所述的载体。
44.一种组合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna，或权利要求40或权利要求41所述的分离的多核苷酸，以及任选地，药学上可接受的运载体。
45.如权利要求44所述的组合物，其中，所述药学上可接受的运载体选自下组：水性运载体、脂质体、高分子聚合物、多肽和抗体。
46.如权利要求44或45所述的组合物，其中，所述组合物包含0.001-200nm的sarna。
47.如权利要求46所述的组合物，其中，所述组合物包含1-200nm的sarna。
48.一种sarna，其包含长度范围为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，用于活化/上调细胞中utrn基因的表达，其中所述寡核苷酸序列与seq id no:1200的等长部分具有至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％的序列同源性或互补性，其中所述sarna使utrn基因的表达与其基线表达相比活化至少10％。
49.如权利要求48所述的sarna，其中，seq id no:1200的等长区域位于utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496(seq id no:1207)、区域-351至-294(seqid no:1208)、区域-236至-187(seq id no:1209)或区域-101至-65(seq id no:1210)。
50.如权利要求49所述的sarna，其中所述sarna包含正义链和反义链，其中所述正义链包含选自seq id no:400-797的核苷酸序列，而所述反义链包含选自seqid no:800-1197的核苷酸序列。
51.一种用于活化/上调细胞中utrn基因表达的产品，其中所述产品使utrn基因的表达与所述utrn基因的基线表达相比活化至少10％，并且其中所述产品包含活性物质，所述活性物质选自以下的一种或多种：权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体，或权利要求44-47中任一项所述的组合物。
52.用于活化/上调细胞中utrn基因表达的产品，其中，所述活性物质被直接引入细胞；和/或
53.如权利要求52所述的产品，其中，所述活性物质通过以下方式直接引入细胞：
54.如权利要求53所述的产品，其中，所述偶联部分独立地衍生自荧光团、配体、糖类、肽和抗体。
55.用于活化/上调细胞中utrn基因表达的产品，其中，所述细胞来自患有由utrn蛋白表达不足、utrn基因突变和/或功能性utrn低水平引起的疾病或病症或有患上此疾病或病症的风险的患者，其中所述活性物质以足以预防或治疗所述疾病或病症，例如，杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)的量给予。
56.一种预防或治疗由个体中抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平诱导的疾病或病症的方法，其包括：给予所述个体有效量的权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体，或权利要求44-46中任一项所述的组合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述疾病或病症是抗肌萎缩蛋白缺乏症(ddd)。
58.如权利要求56所述的方法，其中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)。
59.如权利要求56所述的方法，其中，所述个体是哺乳动物，任选地其中所述个体是人。
60.如权利要求56所述的方法，其中，所述个体具有由个体中抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平引起的症状。
61.如权利要求56所述的方法，其中，向个体给予权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物，所述给予通过选自以下的一种或多种给予途径进行：肠胃外输注，经口给予，鼻内给予，吸入给予，阴道给予和直肠给予。
62.如权利要求61所述的方法，其中，给予途径选自以下的一种或多种：鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、脑室内、玻璃体内和皮下给予。
63.如权利要求56所述的方法，其中，所述方法使utrn基因mrna在个体中的表达相比utrn基因的基线表达活化/上调至少10％。
64.如权利要求56所述的方法，其中，所述方法使个体中抗肌萎缩蛋白相关蛋白的水平与utrn基因的基线表达相比增加至少10％。
65.一种用于检测权利要求43所述的宿主细胞中的抗肌萎缩蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或抗肌萎缩蛋白相关的蛋白质(例如肌萎缩聚糖)的方法。
66.一种用于进行权利要求56所述的方法的试剂盒，其包含a)权利要求1-25所述的sarna。
67.如权利要求66所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含：b)使用说明，和c)任选地，用于向个体给予权利要求1-25中任一项所述的sarna的器具。
68.一种试剂盒，其在带标签的包装件中包含权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物，并且所述包装件上的标签指示所述sarna、所述分离的多核苷酸、所述载体或所述组合物能用于预防或治疗由抗肌萎缩蛋白表达不足诱导的疾病或病症，或针对杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)。
69.一种用于检测权利要求43所述的宿主细胞中的抗肌萎缩蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白或抗肌萎缩蛋白相关的蛋白质(例如肌萎缩聚糖)的试剂盒。
70.如权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物在制备用于预防或治疗由个体中抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平诱导的疾病或病症的药物中的用途。
71.如权利要求70所述的用途，其中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)。
72.如权利要求70所述的用途，其中，所述个体是哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物是人。
73.如权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物在制备用于活化/上调细胞中utrn基因的表达的制剂中的用途。
74.如权利要求73所述的用途，其中，权利要求1-25中任一项所述的sarna，或权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物被直接引入细胞中。
75.如权利要求74所述的用途，其中，所述sarna在将编码所述sarna的核苷酸序列引入所述细胞之后在所述细胞中产生。
76.如权利要求73-75中任一项所述的用途，其中，所述细胞是哺乳动物细胞，任选地其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
77.如权利要求76所述的用途，其中，所述细胞在人体中。
78.如权利要求77所述的用途，其中，所述人体是具有由个体中抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平诱导的症状的对象，其中所述sarna、分离的多核苷酸或组合物以足以治疗所述症状的量给予。
79.如权利要求78所述的用途，其中由抗肌萎缩蛋白表达不足诱导的症状是杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)。
80.一种用于活化/上调utrn基因在细胞中的表达的方法，其包括：向所述细胞给予有效量的权利要求1-25中任一项所述的sarna，权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸，权利要求42所述的载体，或权利要求44-47中任一项所述的组合物。
81.如权利要求80所述的方法，其中，权利要求1-25中任一项所述的sarna，权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物被直接引入细胞中。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述方法用于向细胞中直接引入，所述方法包括：
83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如来自人体的细胞。
84.如权利要求83所述的方法，其中，所述人体是具有由个体中抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或功能性抗肌萎缩蛋白低水平诱导的症状的对象，其中所述sarna、分离的多核苷酸或组合物以足以治疗所述症状的量给予。
85.如权利要求84所述的方法，其中由抗肌萎缩蛋白表达不足造成的症状是杜氏肌营养不良症(dmd)或贝克尔肌营养不良症(bmd)。
86.一种用于提高细胞中抗肌萎缩蛋白相关蛋白的水平的方法，其包括向所述细胞引入有效量的权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸、权利要求42所述的载体或权利要求44-47中任一项所述的组合物中的sarna，其中所述sarna、分离的多核苷酸或组合物使utrn基因的表达相比utrn基因的基线表达活化至少10％。
