本技术属于生物检测领域，具体涉及一种特定来源的外泌体的表征方法。
背景技术：
1、外泌体是细胞分泌的一种胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)，在较长的时间内被认为是细胞分泌的废弃物，1987年johnstone将其命名为“exosome”即外泌体。外泌体中包含了复杂的rna和蛋白质，是细胞间信息传递的重要物质。多种细胞在正常和病理状态下均可分泌外泌体，并释放于人体的体液中，包括血液、泪液、尿液、脑脊液、乳汁等都富含外泌体，其与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关的疾病以及癌症的进展有关(kalluri r,lebleu vs.the biology,function,and biomedicalapplications of exosomes.science.367:6478(2020))。此外，现有技术表明外泌体的浓度与膜蛋白种类都与组织细胞的状态有关，例如精浆外泌体与精子成熟度有关(sullivanr,saez f,girouard j,frenette g,role of exosomes in sperm maturation duringthe transit along the male reproductive tract.blood cells mol.dis 35:1–10(2005))，富含热休克蛋白(hsp70和hsp90)的小鼠和人类癌细胞衍生的外泌体在功能上也与小鼠肌肉萎缩有关(zhang g et al.,tumor induces muscle wasting in micethrough releasing extracellular hsp70 and hsp90.nat.commun 8:589(2017))。此外，对外泌体的研究还可能有助于确定细胞通讯、器官稳态和疾病中位置的细胞机制和分子机制(kalluri r,lebleu vs.the biology,function,and biomedical applications ofexosomes.science.367:6478(2020))。
2、因此，鉴定特定组织中外泌体的含量、粒径分布以及电位等，对于研究外泌体及其在特定组织中的功能或该组织的生理状态均至关重要。
技术实现思路
1、本技术的目的在于提供一种表征外泌体的方法，特别是一种表征特定来源的外泌体的方法。
2、在一个方面，本技术提供了一种表征特定来源的外泌体的方法，其包括如下步骤：
3、1)将含有待测外泌体的样本与特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的固相介质混合以使所述待测外泌体与所述固相介质结合；
4、2)将结合至所述固相介质的待测外泌体与未结合至所述固相介质的外泌体分离；
5、3)将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合，以使所述待测外泌体脱离于所述固相介质；
6、4)将脱离于所述固相介质的所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽，所述纳米单颗粒检测仪包含通过一个纳米孔相连的样品槽和稀释槽，所述样品槽和稀释槽中分别有一个电极；
7、5)在所述样品槽和稀释槽的两个电极上施加电压或者电流，使得所述待测外泌体以单颗粒形式通过所述纳米孔从样品槽进入到稀释槽，从而在电极上产生电压或者电流的脉冲；和
8、6)通过测量所述电压或电流的脉冲信号得到所述待测外泌体的粒径、浓度和/或电位信息。
9、在某些实施方式中，所述固相介质带有特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的抗体或适配体。在某些实施方式中，所述表面膜蛋白为能够指示外泌体来源的生物标志物。
10、在某些实施方式中，步骤1)中所述固相介质为磁珠。
11、在某些实施方式中，步骤1)包含如下子步骤：
12、1-1)将样本与所述磁珠混合；
13、1-2)将与样本混合的磁珠置于磁场中，通过磁场将结合了所述待测外泌体的磁珠集中在局部区域，分离结合了所述待测外泌体的磁珠。
14、在某些实施方式中，所述固相介质为板块或大粒径硅球。
15、在某些实施方式中，所述表面膜蛋白为epcam、cd81或egfr。
16、在某些实施方式中，步骤2)中所述解离液中包含蛋白酶类，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或者蛋白酶k。在某些实施方式中，所述解离液中还包含0.1-0.5％v/v表面活性剂。在某些实施方式中，所述表面活性剂选自由吐温20、吐温80和曲拉通x-100组成的群组中的一种或多种。
17、在某些实施方式中，步骤2)中所述解离液中包含强酸/强碱溶液、有机酸和变性剂中的一种或多种。
18、在某些实施方式中，所述强酸/强碱溶液为gly-hcl溶液或者naoh溶液。
19、在某些实施方式中，所述变性剂为dtt、盐酸胍或者β-巯基乙醇。
20、在某些实施方式中，所述有机酸为水杨酸。
21、在某些实施方式中，步骤4)中在将所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽前，对所述待测外泌体进行均匀分散。在某些实施方式中，通过超声和/或表面活性剂进行所述均匀分散。在某些实施方式中，所述表面活性剂选自由吐温20、吐温80和曲拉通x-100组成的群组中的一种或多种。
22、在某些实施方式中，步骤4)中所述纳米孔的孔径为500nm以下。
23、在某些实施方式中，步骤4)中所述纳米孔的孔深为1μm以下。
24、尽管本技术将在以下公开多个方面和实施方式，但是在不违背本技术主题精神和范围的前提下，本领域技术人员显然可以对其进行各种等同改变和修改。本技术公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本技术，本技术的实际保护范围以权利要求为准。除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本技术所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本技术中引用的所有参考文献、专利、专利申请均通过整体引用并入本文。
25、定义
26、“外泌体(exosome)”是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。依据待测外泌体的来源不同，其表面膜蛋白也有所不同；例如，来自直肠癌病人的血清样本中的表面膜蛋白可为epcam，来自丙型肝炎感染患者的血清样本中的表面膜蛋白可为cd81，来自非小细胞肺癌患者的血清样本中的表面膜蛋白可为egfr，来自胃癌患者的血清样本中的表面膜蛋白可为gkn1，来自膀胱癌患者的尿液样本中的表面膜蛋白可为pcat-1，来自乳腺癌患者的血浆样本中的表面膜蛋白可为del-1，来自胰腺癌患者的外周血和门静脉血样本中的表面膜蛋白可为gpc1(wang x,huang j,chen w,lig,li z,lei j.the updated role of exosomal proteins in the diagnosis,prognosis,and treatment of cancer.exp mol med.54(9):1390-1400(2020))。
27、本技术中的“纳米库尔特(nanocoulter)技术”，其基于纳米库尔特原理，在测试过程中将待测颗粒分散在电解液中，随其通过特定孔径的纳米孔芯片，颗粒通过纳米孔的一瞬间会占用相同体积电解液的位置，在孔内外两电极间的电阻(恒电流设计的电路)会发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的强度和次数与通过纳米孔的颗粒大小及数目成一定比例，直接将脉冲信号进行转换，即可获得所检测样本中颗粒的粒径和粒子数信息。
28、本技术中的术语“纳米粒子示踪”，英文全称为nanoparticle tracking analysis(简称nta)，是一种可视化分析液体中颗粒的方法，它将布朗运动速率与颗粒大小联系起来。移动速率仅与液体的粘度、颗粒的温度和尺寸有关，不受颗粒密度或折射率的影响。通过该方法可以获得其所处理的颗粒的基本数据，包括平均粒径、模态值(modal value)和粒径分布。典型的nta设备由激光模块、连接到灵敏电荷耦合器件(ccd)或互补金属氧化物半导体(cmos)相机的显微镜、液压泵和测量室组成。还应指出，在实际测量之前，应在nta软件中适当规定测量条件(温度和粘度)。接下来，安装在光学显微镜上的高灵敏度摄像机将记录被照射粒子在特定时间段内的运动。从获取的视频记录中，每个粒子的位移被跟踪并绘制为时间的函数，这使得能够通过应用二维斯托克斯-爱因斯坦方程来计算粒子尺寸分布。
29、本技术中的术语“样本”可为常规的生物试样，包括但不限于体液、细胞培养上清液、组织细胞的破碎液等各种液体。所述体液，包括但不限于全血、血清、血浆、各种血细胞、血块、血小板等、以及尿、精液、母乳、汗、间质液、间质性淋巴液、骨髓液、组织液、唾液、胃液、关节液、胸腔积液、胆汁、腹水、羊水等。在某些实施方式中，所述样本为血清。此外，生物试样的来源可为常规哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、犬、猪、绵羊、牛、马、骆驼、猴等。在某些实施方式中，样本来源于人。在某些实施方式中，所述样本为来源于人的血清。
30、本技术中的术语“固相介质”可为本领域中常规的固相介质，其材质包括但不限于高分子化合物、玻璃、金属、磁性体、包含磁性体的树脂组合物及其组合；其中高分子化合物例如为聚苯乙烯类、聚乙烯类、聚丙烯类、聚酯类、聚(甲基)丙烯腈类、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯类、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等。本技术中固相介质的形状没有特别限定，可举出例如，托盘状、球状(例如大粒径硅球)、粒子状、纤维状、棒状、盘状、容器状、微流路、板块。在本技术中，出于固液分离、洗涤的容易性等方面考虑，优选使用磁性粒子作为固相介质。上述磁性粒子可为由四三氧化铁(fe3o4)、三氧化二铁(γ-fe2o3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属形成的磁性体微粒，和由这些金属的合金形成的磁性体微粒，以及树脂中包含这些磁性体微粒的磁性粒子。作为树脂，可举出例如，疏水性聚合物、亲水性聚合物等。
31、本技术中的“适配体”(adaptor)特指一种蛋白，其结构中包含至少一个能够与其他特定蛋白特异性相互作用的结构域。
32、本技术中的术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重链和两条轻链。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链包含可变区(vh)和第一、第二、第三和任选的第四恒定区(分别为ch1、ch2、ch3、ch4)；哺乳动物轻链分为λ和κ，而每条轻链都包含一个可变区(vl)和一个恒定区。抗体具有“y”形，y的茎由包含通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。y的每个臂包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(cdr)(轻链cdr包括lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链cdr包括hcdr1、hcdr2、hcdr3)。三个cdr位于称为框架区(fr)的侧翼片段之间(轻链fr包括lfr1、lfr2、lfr3和lfr4，重链fr包括hfr1、hfr2、hfr3和hfr4)，相比于cdr，框架区高度保守。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出多种效应功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列进行分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别分为igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)等亚类。
33、本技术中的术语“强酸”指的是在溶液中完全电离的酸，示例性的强酸包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、氯酸、高氯酸、硒酸、高锰酸等。
34、本技术中的术语“强碱”指的是在水溶液中电离出的阴离子全部是氢氧根离子的物质，示例性的强碱包括但不限于氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙等。
35、本技术中的术语“有机酸”指的是具有酸性的有机化合物，常见的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸(即维生素c)等，芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。
36、本技术中的术语“蛋白酶”指的是水解蛋白质肽键的一类酶，示例性的蛋白酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k等。
37、本技术中的术语“变性剂”特指“蛋白变性剂”，是指能够使得蛋白质发生变性作用的试剂，其可以改变蛋白质分子内部结构(例如二级结构、三级结构)和性质；本技术中示例性的蛋白变性剂包括但不限于二硫苏糖醇(dl-dithiothreitol，dtt)、盐酸胍、尿素、半胱氨酸、抗坏血酸和β-巯基乙醇等。
38、本技术中的术语“epcam”指的是上皮细胞粘附分子，也称为cd326，是一种单通道的i型质膜糖蛋白，同型ca2+非依赖性细胞粘附分子。
39、本技术中的术语“cd81”是四跨膜蛋白超家族(tm4sf)成员，为分子量为25kd的跨膜四分子蛋白。
40、本技术中的术语“egfr”是表皮生长因子受体，英文全称为epidermal growthfactor receptor，其广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，egfr信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。
41、如本技术所用，术语“治疗”是指治疗性处理，其中目的是反转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的状况的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果减少一种或多种症状或临床标志物，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”，也就是说，“治疗”不仅包括症状的改善，而且还包括在缺乏治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止，至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、和缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是检测不到的。
42、如本技术所用，术语“受试者”和“患者”在本技术中可互换使用，并且是指动物，例如人类。术语受试者还包括“非人哺乳动物”，例如如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。在优选的实施方式中，所述受试者是人类受试者。
43、在本技术的一些实施方式中，所述疾病是癌症。癌症的具体实例包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；胶质母细胞瘤；肝癌；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；b细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病等。
44、表征特定来源的外泌体的方法
45、在本技术的第一方面，提供一种表征特定来源的外泌体的方法，所述方法包括如下步骤：
46、a)将含有待测外泌体的样本与特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的固相介质混合以使所述待测外泌体与所述固相介质结合；
47、b)将结合至所述固相介质的待测外泌体与未结合至所述固相介质的外泌体分离；
48、c)将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合，以使所述待测外泌体脱离于所述固相介质；
49、d)通过纳米单颗粒检测技术检测脱离于所述固相介质的待测外泌体。
50、在某些实施方式中，所述纳米单颗粒检测技术为纳米库尔特技术或者纳米粒子示踪技术等能够对纳米颗粒进行表征的技术。
51、在某些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
52、1)将含有待测外泌体的样本与特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的固相介质混合以使所述待测外泌体与所述固相介质结合；
53、2)将结合至所述固相介质的待测外泌体与未结合至所述固相介质的外泌体分离；
54、3)将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合，以使所述待测外泌体脱离于所述固相介质；
55、4)将脱离于所述固相介质的所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽，所述纳米单颗粒检测仪包含通过一个纳米孔相连的样品槽和稀释槽，所述样品槽和稀释槽中分别有一个电极；
56、5)在所述样品槽和稀释槽的两个电极上施加电压或者电流，使得所述待测外泌体以单颗粒形式通过所述纳米孔从样品槽进入到稀释槽，从而在电极上产生电压或者电流的脉冲；和
57、6)通过测量所述电压或电流的脉冲信号得到所述待测外泌体的粒径、浓度和/或电位信息。
58、在某些实施方式中，在对所述待测外泌体进行检测前，对其进行均匀分散。不受任何理论的限制，但认为进行所述均匀分散至少可以提高检测的准确性。
59、在某些实施方式中，步骤4)中在将所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽前，对所述待测外泌体进行均匀分散。在某些实施方式中，所述均匀分散的方法包括但不限于搅拌、超声、磁场、振荡以及表面活性剂的使用等物理化学手段。在某些实施方式中，所述表面活性剂选自由吐温20、吐温80和曲拉通x-100组成的群组中的一种或多种。
60、应理解，根据纳米孔的作用，其孔径以及孔深的设定均需以能够容纳所述待测外泌体为基本前提。然而，兼顾到检测准确性等目的，在某些实施方式中，步骤4)中所述纳米孔的孔径为500nm以下，例如为200-500nm。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔径为500nm、470nm、450nm、430nm、410nm、400nm、390nm、350nm、320nm、300nm、280nm、250nm、230nm、200nm或以上任何两个数值之间的数值或范围。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔深为1μm以下。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔深为1μm、0.95μm、0.93μm、0.9μm、0.88μm、0.85μm、0.82μm、0.8μm、0.75μm、0.7μm、0.65μm、0.6μm、0.55μm、0.5μm、0.45μm、0.4μm、0.35μm或以上任何两个数值之间的数值或范围。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔径为500nm，且孔深为0.5μm。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔径为400nm，且孔深为0.5μm。在某些实施方式中，所述纳米孔的孔径为400nm，且孔深为0.4μm。
61、在某些实施方式中，所述固相介质带有特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的抗体或适配体。应理解，在明确待测外泌体的特定来源的前提下，所述待测外泌体的生物标志物(例如表面膜蛋白)也能够相应确定，进而据此选择用于连接到固相介质上的抗体或适配体的种类。在某些实施方式中，所述表面膜蛋白依据待测外泌体的来源可为epcam、cd81或egfr。
62、在某些实施方式中，步骤1)中的所述固相介质为磁珠。在某些实施方式中，步骤1)包含如下子步骤：1-1)将样本与所述磁珠混合；1-2)将与样本混合的磁珠置于磁场中，通过磁场将结合了所述待测外泌体的磁珠集中在局部区域，分离结合了所述待测外泌体的磁珠。
63、在某些实施方式中，在子步骤1-1)中，所述样本与所述磁珠在溶液中进行混合得到固液混合物。不受任何理论的限制，但是认为该固液混合物中含有、但不限于结合了所述待测外泌体的磁珠、未结合至所述磁珠的外泌体以及未结合外泌体的磁珠等。在某些实施方式中，在子步骤1-2)中，将所述固液混合物置于磁场中，以通过磁场将结合了所述待测外泌体的磁珠集中在局部区域。
64、在某些实施方式中，为了尽可能提高子步骤1-2)所述局部区域中的结合了待测外泌体的磁珠的纯度，可加入清液替换掉磁场区域的液体(其中，清液是不包含对颗粒检测构成干扰的颗粒的液体，例如可为样本稀释液)，该操作可重复一次或多次，使得样本中的非待检测颗粒随着液体的替换被清理掉，最终无限接近清液中只含有结合了待检测外泌体的磁珠的状态。
65、在某些实施方式中，所述固相介质为板块或大粒径硅球。在某些实施方式中，所述大粒径硅球为粒径大于2μm的硅球。
66、在某些实施方式中，步骤2)中所述解离液中包含蛋白酶类，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、金属蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶或者蛋白酶k。不受任何理论的限制，但是认为解离液中的蛋白酶可以水解表面膜蛋白和/或其抗体或适配体，由此使得待测外泌体脱离于固相介质。在某些实施方式中，所述蛋白酶类占所述解离液的0.1-0.5％v/v。在某些实施方式中，所述解离液还包含20-50mm能够调节解离液至合适ph的缓冲液，例如tris缓冲液、pbs缓冲液等。在某些实施方式中，所述解离液还包含0.1-0.5％v/v有助于颗粒分散的表面活性剂，例如吐温20、吐温80、曲拉通x-100等。在某些实施方式中，所述表面活性剂在所述解离液中的浓度为0.5％v/v。在某些实施方式中，所述解离液还包含50-100mm能够调节外泌体的渗透压的盐成分，例如nacl、kcl等解离盐。
67、在某些实施方式中，所述解离液包含20mm tris缓冲液、0.1％v/v胰蛋白酶、0.1％v/v tween20、10mm edta以及100mm nacl。在某些实施方式中，所述解离液包含20mm tris缓冲液、0.1％v/v胰蛋白酶、0.1％v/v tween20、10mm edta以及50mm nacl。在某些实施方式中，所述解离液包含20mm tris缓冲液、0.1％v/v蛋白酶k，0.1％v/v tween20，10mm edta以及100mm nacl。在某些实施方式中，所述解离液包含20mm tris缓冲液、0.1％v/v蛋白酶k，0.1％v/v tween20，10mm edta以及50mm nacl。在某些实施方式中，所述解离液包含50mmtris缓冲液、0.5％v/v木瓜蛋白酶，0.5v/v tween20，10mm edta以及100mm nacl。
68、在某些实施方式中，步骤2)中所述解离液中包含强酸/强碱溶液、有机酸和变性剂中的一种或多种。不受任何理论的限制，但是认为强酸/强碱溶液、有机酸和变性剂中的一种或多种可以使表面膜蛋白和/或其抗体或适配体变性，由此使得待测外泌体脱离于固相介质。在某些实施方式中，所述强酸/强碱溶液例如为gly-hcl溶液或者naoh溶液。在某些实施方式中，所述变性剂选自由二硫苏糖醇、盐酸胍和β-巯基乙醇组成的群组中的一种或多种。在某些实施方式中，所述有机酸为水杨酸。在某些实施方式中，所述解离液包含20mmtris缓冲液、0.2％v/v gly-hcl、0.1％v/v tween20、10mm edta以及100mm nacl。
69、为使解离液充分发挥其作用，步骤3)中，将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合后，将两者在解离液中的活性成分能够发挥其解离作用的环境中孵育一段时间。在某些实施方式中，在将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合后，于37℃下孵育30分钟。
70、在某个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
71、1)将包含待测外泌体的样本与磁珠在溶液中进行混合，该磁珠上有与待测外泌体的表面膜蛋白特异性结合的抗体或适配体；通过抗体或适配体与表面膜蛋白的特异性结合，所述抗体或适配体选择性结合该待测外泌体；
72、2)将步骤1)产生的混合物置于磁场中，结合了所述待测外泌体的磁珠被磁力吸附在磁场中的局部区域，再加入清液替换掉磁场区域的混合物，使非待测颗粒随着混合物的替换被清理掉，得到磁场区域中只含有结合了待测外泌体的磁珠的液体；
73、3)向步骤2)得到的液体中加入解离液(可含有，例如胰蛋白酶或者水杨酸)，使待测外泌体从磁珠上脱离下来；
74、4)向步骤3)所得混合物施加磁力，使磁珠沉降或者聚集到局部区域，并在磁珠聚集之外的区域取上清液；
75、5)使用纳米库尔特技术对上清液中的待测外泌体颗粒进行检测；具体地：在纳米孔的两侧分别是样品液槽和稀释液槽，样品液槽和稀释液槽中分别有一个电极，上述上清液加入液体样品、稀释液槽加入电解液时，在两个电极上施加电压或者电流中的一个，样品中的外泌体颗粒通过纳米孔从样品液槽进入到稀释液槽，在电极上产生电流或者电压的脉冲，通过测量电压或者电流的脉冲信号得到样本中外泌体的粒径、浓度和电位信息。
76、在另一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
77、1)将包含待测外泌体的样本与固相介质进行充分接触，该固相介质上载有与待测外泌体的表面膜蛋白特异性结合的抗体或适配体；
78、2)使用清液将载有待测外泌体的固相介质进行一次或多次冲洗，使得固相介质上尽可能仅结合待测外泌体，而无其他颗粒物质；
79、3)向固相介质加入解离液，使待测外泌体从固相介质上脱离下来、分散至周围液体环境；
80、4)将固相介质从步骤3)所得混合物中分离出去，保留上清液；
81、5)使用纳米粒子示踪技术对上清液中的待测外泌体颗粒进行检测。
82、疾病的诊断和治疗方法
83、上述表征特定来源的外泌体的方法可得出所测外泌体的粒径、浓度以及电位信息中的一种或多种，在获得外泌体的以上指标后，可通过对该指标的进一步分析以获悉外泌体所来源于的特定组织的功能或该组织的生理状态。
84、在本技术的第二方面，提供一种疾病的诊断方法，其包括：在基于本技术第一方面提供的方法确定特定来源的外泌体的粒径、浓度以及电位信息中的一种或多种后，将以上指标与阳性样本和/或阴性样本进行比较，进而判定样本来源的受试者是否患有某种疾病。具体地：
85、1)将含有待测外泌体的样本与特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的固相介质混合以使所述待测外泌体与所述固相介质结合；
86、2)将结合至所述固相介质的待测外泌体与未结合至所述固相介质的外泌体分离；
87、3)将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合，以使所述待测外泌体脱离于所述固相介质；
88、4)将脱离于所述固相介质的所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽，所述纳米单颗粒检测仪包含通过一个纳米孔相连的样品槽和稀释槽，所述样品槽和稀释槽中分别有一个电极；
89、5)在所述样品槽和稀释槽的两个电极上施加电压或者电流，使得所述待测外泌体以单颗粒形式通过所述纳米孔从样品槽进入到稀释槽，从而在电极上产生电压或者电流的脉冲；
90、6)通过测量所述电压或电流的脉冲信号得到所述待测外泌体的粒径、浓度和/或电位信息；和
91、7)将所述粒径、浓度和/或电位信息与阳性样本和/或阴性样本进行比较，进而判定样本来源的受试者是否患有某种疾病。
92、如上所述，现有技术中已经有越来越多有关特定疾病的患者中其体液外泌体上带有特定的生物标志物(例如表面膜蛋白)的记载，简言之：外泌体的生物标志物，特别是表面标志物可提供疾病(例如肿瘤)生物学信息。举例来说，在应用过程当中，已知直肠癌患者的血清样本中外泌体的表面膜蛋白epcam过量表达，则可以据此检测疑似直肠癌患者血清中外泌体上的epcam是否过量表达，再选择性地结合其他诊断方法对疑似直肠癌患者进行确诊或者排除。在某些实施方式中，可预先通过多例阳性样本与阴性样本上特定表面膜蛋白(已知其在患者体液的外泌体上过表达或者特异性表达)的表达量设定cutoff值，之后将疑似患者中该表面膜蛋白的表达量与该cutoff值进行比较，通过该比较结果对疑似患者进行确诊或排除。
93、在本技术的第三方面，提供一种疾病的治疗方法，其包括：在基于本技术第二方面提供的诊断方法确定样本来源的受试者患有某种疾病后，对所述受试者进行治疗。具体地：
94、1)将含有待测外泌体的样本与特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的固相介质混合以使所述待测外泌体与所述固相介质结合；
95、2)将结合至所述固相介质的待测外泌体与未结合至所述固相介质的外泌体分离；
96、3)将结合至所述固相介质的待测外泌体与解离液混合，以使所述待测外泌体脱离于所述固相介质；
97、4)将脱离于所述固相介质的所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽，所述纳米单颗粒检测仪包含通过一个纳米孔相连的样品槽和稀释槽，所述样品槽和稀释槽中分别有一个电极；
98、5)在所述样品槽和稀释槽的两个电极上施加电压或者电流，使得所述待测外泌体以单颗粒形式通过所述纳米孔从样品槽进入到稀释槽，从而在电极上产生电压或者电流的脉冲；
99、6)通过测量所述电压或电流的脉冲信号得到所述待测外泌体的粒径、浓度和/或电位信息；
100、7)将所述粒径、浓度和/或电位信息与阳性样本和/或阴性样本进行比较，进而判定样本来源的受试者是否患有某种疾病；和
101、8)在所述受试者确诊后，对其进行治疗。
102、使用本技术的方法能够对特定来源的外泌体进行表征，主要包括对待测外泌体进行结合、清洗、洗脱并通过纳米单颗粒检测仪对外泌体进行检测的步骤，流程简单、耗时短、特异性强且化学试剂稳定。此外，可将该表征方法进一步应用于疾病的诊断和治疗，基于该表征方法的诊疗方法具有检测准确度高、检测速度快等优势，为本领域中基于外泌体的全新诊疗方法。
1.一种表征特定来源的外泌体的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相介质带有特异性结合待测外泌体的表面膜蛋白的抗体或适配体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面膜蛋白为能够指示外泌体来源的生物标志物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述固相介质为磁珠。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)包含如下子步骤：
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相介质为板块或大粒径硅球，例如粒径大于2μm的硅球。
7.如权利要求1述的方法，其特征在于，所述表面膜蛋白为epcam、cd81或egfr；
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述解离液中包含蛋白酶类，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或者蛋白酶k。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述解离液中还包含0.1-0.5％v/v表面活性剂；例如吐温20、吐温80或者曲拉通x-100。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述解离液中包含强酸/强碱溶液、有机酸和变性剂中的一种或多种。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述强酸/强碱溶液为gly-hcl溶液或者naoh溶液；
12.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中在将所述待测外泌体转移到纳米单颗粒检测仪的样品槽前，对所述待测外泌体进行均匀分散；
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自由吐温20、吐温80和曲拉通x-100组成的群组中的一种或多种。
14.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述纳米孔的孔径为500nm以下；
