本发明涉及微生物，尤其涉及一种猫支原体mycoplasma felis-28株及其分离、保存和应用。
背景技术：
1、支原体(mycoplasma)属于原核生物界目前发现的最小的最简单的可在无活细胞培养基生长的无细胞壁微生物。支原体形态具有多形性，其分布广泛，种类繁多，可感染多种动植物，具有条件致病性，目前已知支原体有80余种。猫呼吸道支原体是猫支原体的一种引起上呼吸道炎症的病原，可通过空气和呼吸道分泌物传播，易与其他呼吸道病原混合感染导致猫呼吸道综合征，出现精神沉郁，脓性眼鼻分泌物等临床症状，难以根治。动物呼吸道支原体不侵入组织或血液，大部分粘附于呼吸道上皮细胞，通过不同机制造成细胞损伤后释放外毒素进而影响机体，生活环境脏乱、免疫力低下的猫易感，近些年猫支原体感染率逐渐升高。
2、目前支原体防控主要依赖于抗菌物质(抗生素、消毒剂)，但抗菌物质的使用存在误用及耐药增加的问题，宠物主更倾向于使用疫苗免疫来提前预防。近些年宠物医院等逐渐开始关注猫支原体的检测和防控，主要使用抗生素和抗菌药物治疗。但因支原体存在难保存、难培养等问题，故国内迄今未有商业化的猫支原体疫苗。
3、有鉴于此，有必要筛选一株猫支原体，并建立其分离、保存方法开发这一株猫支原体灭活疫苗的应用，以解决上述问题。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一株猫支原体mycoplasmafelis-28株，且为之建立分离、保存的方法，与此同时以该菌株为抗原研制保护效果较好的疫苗。
2、为实现上述目的，本发明提供了一株猫支原体mycoplasma felis-28株，所述猫支原体mycoplasma felis-28株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202394，保藏日期：2023年10月18日。
3、本发明还提供了一种猫支原体mycoplasma felis-28株的分离方法，包括如下步骤：
4、(1)取疑似猫呼吸道支原体阳性病料拭子涂布于葡萄糖固体培养基上；
5、(2)取所述葡萄糖固体培养基上的所述猫支原体mycoplasma felis-28株的单菌落；
6、(3)将所述单菌落接种到葡萄糖液体培养基中；当所述葡萄糖液体培养基的颜色发生改变时，收取所述葡萄糖液体培养基中的培养液，并涂布于新的葡萄糖固体培养基上；
7、(4)当(3)中的所述葡萄糖固体培养基的颜色发生改变时，再收取(3)中所述葡萄糖固体培养基上的支原体单菌落接种于葡萄糖液体培养基，并重复步骤(3)的方式进行纯化；整个纯化过程共持续3个周期，且纯化过程中pcr能检测到所述猫支原体mycoplasmafelis-28株，即完成对所述猫支原体mycopla sma felis-28株的克隆纯化。
8、进一步地，所述pcr检测包括根据genbank登录的支原体基因组全长序列设计16s基因全长特异性引物进行检测：
9、所述16s基因全长特异性引物为：
10、上游引物16s-f：5'-agagtttgatcctggctcagga-3
11、下游引物16s-r：5'-ggtagggataccttgttacgact-3'；
12、引物扩增片段大小为1512bp。
13、进一步地，所述葡萄糖液体培养基的制备过程包括：先将21.0g的pplo肉汤粉、5.0g的葡萄糖溶于850ml双蒸水中；再依次向其中加入10ml浓度为400万iu/ml的青霉素、1.0ml浓度为1％w/v的酚红溶液、1.0ml浓度为0.1mol/ml的nad；待完全溶解后，用浓度为1mol/l的naoh调ph值至7.6～7.8；接着用双蒸水定容至1000ml；最后将配置的溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后，于2～8℃保存。
14、进一步地，所述葡萄糖固体培养基的制备过程包括：先将21.0g的pplo肉汤粉、5.0g的葡萄糖溶于850ml双蒸水中；再依次向其中加入1.0ml浓度为1％w/v的酚红溶液、10.0g琼脂糖；待完全溶解后，用1mol/l的naoh调ph值至7.6～7.8；接着用双蒸水定容至1000ml；随后将配好的溶液加热至116℃除菌15min；待温度降至55～65℃时，又向溶液中依次加入100ml猪血清、1.0ml浓度为400万iu/ml的青霉素、1.0ml浓度为0.1mol/ml的nad；待溶液混合均匀后倒入平板中，凝固后，于2～8℃保存。
15、本发明还提供了一种猫支原体mycoplasma felis-28株的保存方法，包括如下步骤：
16、s1、获取猫支原体mycoplasma felis-28株的菌种沉淀
17、将所述猫支原体mycoplasma felis-28株进行离心且弃上清液后，收集猫支原体mycoplasma felis-28株的菌种沉淀；
18、s2、制备冻干保存液
19、将由pbs溶液、终浓度为10％w/v的明胶、终浓度为5％w/v的海藻糖和终浓度为35％w/v的蔗糖混合而成的溶液加热至116℃并保温30min后冷却至37℃，即制得冻干保存液；
20、s3、将所述猫支原体mycoplasma felis-28株的菌种沉淀以所述冻干保存液重悬；
21、s4、将经过重悬的猫支原体mycoplasma felis-28株的菌种沉淀进行冻干后于-80℃保存。
22、本发明还提供了一种猫支原体mycoplasma felis-28株在制备猫支原体感染疫苗中的应用。
23、进一步地，所述疫苗的组分包括：由灭活的猫支原体mycoplasma felis-28株所得到的抗原液、饱和海藻糖溶液、pbs溶液、佐剂；其中，抗原液、饱和海藻糖溶液、pbs溶液、佐剂的体积比为8.5:5:76.5:10；在所述疫苗中，所述抗原液的浓度为109.0ccu/ml。
24、进一步地，所述佐剂包括montanidetmgel02佐剂。
25、进一步地，由所述猫支原体mycoplasma felis-28株制备的疫苗生产用菌的保存方法，包括如下步骤：
26、sa、将所述灭活的猫支原体mycoplasma felis-28株所得到的抗原液进行离心弃上清液后，收集的沉淀即为猫支原体mycoplasma felis-28抗原液的菌株；
27、进行所述离心的过程为：8000rpm离心10min；
28、sb、制备冻存保护剂
29、将pbs溶液、终浓度为15％w/v的山梨醇、终浓度为5％w/v的海藻糖和终浓度为30％w/v的甘油混合后，加热至116℃并保温30min后冷却至37℃，即制得冻存保护剂；
30、sc、将所述猫呼吸道支原体mycoplasma felis-28抗原液的菌株以所述冻存保护剂重悬后，于-20℃保存。
31、本发明的有益效果是：
32、1、本发明提供的一株猫支原体mycoplasma felis-28株，在16s基因上与国际标准株myco-2遗传进化相近，如此可以用来制备预防猫支原体呼吸道炎症且安全性高、免疫效果好的疫苗。
33、2、本发明提供的一株猫支原体mycoplasma felis-28株及由其制备的疫苗生产用菌的保存方法均可通过糖、醇及甘油的特殊配方在-20℃的方式进行保存，使支原体在保存期间处于凝胶状态后，其中的支原体结构不易被破坏，且保存过程中不易被污染，这与现有的传统冻干方式的严苛环境相比，更为简单；如此，这为细菌的保存方式提供了新的思路，在科研应用上具有重要的意义。
34、3、用本发明的猫支原体mycoplasma felis-28株制备的预防猫支原体呼吸道炎症的疫苗，这种疫苗具有良好的安全性和免疫效果，能满足目前市场上对此类疫苗的迫切需要，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会和生态效益。
1.一株猫支原体mycoplasma felis-28株，其特征在于：所述猫支原体mycoplasmafelis-28株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202394，保藏日期：2023年10月18日。
2.一种猫支原体mycoplasma felis-28株的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的猫支原体mycoplasma felis-28株的分离方法，其特征在于：所述pcr检测包括根据genbank登录的支原体基因组全长序列设计16s基因全长特异性引物进行检测：
4.根据权利要求2所述的猫支原体mycoplasma felis-28株的分离方法，其特征在于：所述葡萄糖液体培养基的制备过程包括：先将21.0g的pplo肉汤粉、5.0g的葡萄糖溶于850ml双蒸水中；再依次向其中加入10ml浓度为400万iu/ml的青霉素、1.0ml浓度为1％w/v的酚红溶液、1.0ml浓度为0.1mol/ml的nad；待完全溶解后，用浓度为1mol/l的naoh调ph值至7.6～7.8；接着用双蒸水定容至1000ml；最后将配置的溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后，于2～8℃保存。
5.根据权利要求2所述的猫支原体mycoplasma felis-28株的分离方法，其特征在于：所述葡萄糖固体培养基的制备过程包括：先将21.0g的pplo肉汤粉、5.0g的葡萄糖溶于850ml双蒸水中；再依次向其中加入1.0ml浓度为1％w/v的酚红溶液、10.0g的琼脂糖；待完全溶解后，用1mol/l的naoh调ph值至7.6～7.8；接着用双蒸水定容至1000ml；随后将配好的溶液加热至116℃除菌15min；待温度降至55～65℃时，又向溶液中依次加入100ml猪血清、1.0ml浓度为400万iu/ml的青霉素、1.0ml浓度为0.1mol/ml的nad；待溶液混合均匀后倒入平板中，凝固后，于2～8℃保存。
6.一种猫支原体mycoplasma felis-28株的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.一种猫支原体mycoplasma felis-28株在制备猫支原体感染疫苗中的应用，其特征在于：所述猫支原体mycoplasma felis-28株为权利要求1中所述猫支原体mycoplasmafelis-28株。
8.根据权利要求7所述的猫支原体mycoplasma felis-28株在制备猫支原体感染疫苗中的应用，其特征在于：所述疫苗的组分包括：由灭活的猫支原体mycoplasma felis-28株所得到的抗原液、饱和海藻糖溶液、pbs溶液、佐剂；其中，抗原液、饱和海藻糖溶液、pbs溶液、佐剂的体积比为8.5:5:76.5:10；在所述疫苗中，所述抗原液的浓度为109.0ccu/ml。
9.根据权利要求8所述的猫支原体mycoplasma felis-28株在制备猫支原体感染疫苗中的应用，其特征在于：所述佐剂包括montanide tm gel 02佐剂。
10.根据权利要求8所述的猫支原体mycoplasma felis-28株在制备猫支原体感染疫苗中的应用，其特征在于：由所述猫支原体mycoplasma felis-28株制备的疫苗生产用菌的保存方法，包括如下步骤：
