本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒及应用。
背景技术：
1、胶质母细胞瘤(gbm)作为中枢神经系统恶性程度和致死率最高的原发性肿瘤，具有致死率极高的特点，中位生存期仅15-17月。目前，针对于胶质母细胞瘤的治疗方式主要以精细手术(最大程度的肿瘤切除)、放化疗及电场治疗联合下的综合治疗为主，但是受肿瘤位置特殊难以完全切除、肿瘤内/肿瘤间高度异质性、微卫星不稳定性、肿瘤微环境以及肿瘤突变负荷等因素的影响，患者极易发生肿瘤复发和放化疗耐受的情况。
2、近年来，免疫治疗在肿瘤治疗中大放异彩，其中dc疫苗通过与淋巴结内循环t细胞接触并将肿瘤特异性抗原呈递给初始t细胞，后者经激活、增殖并募集至肿瘤区域以对胶质瘤细胞产生特异性杀伤作用，目前多项靶向胶质瘤的dc疫苗临床试验取得巨大成功，并且在治疗的有效性及治疗安全性方面具有更加可靠的特性。然而考虑到每个人的免疫系统状态、肿瘤特性以及遗传背景等方面都是不同的，这就导致不同胶质瘤患者对于胶质瘤dc疫苗的响应程度是不同的。在临床上若是能够提前准确地预测潜在胶质瘤dc疫苗的潜在受益人群的话，将极大程度地提高胶质瘤dc疫苗的治疗靶向性。
3、目前，业内认为肿瘤突变负荷、免疫检查点分子表达、肿瘤特异性亚型等生物标志物能够预测相关免疫治疗疗效及患者预后，多数技术是从生物学介质中可以检测到的细胞、生物化学或分子改变，其中生物介质包括各种体液，如血液、尿液、细胞、组织、毛发等，免疫检查点分子的表达、tmb评分需要实体肿瘤标本进行免疫组化染色、全外显子测序，这些预测免疫治疗疗效的方案在胶质瘤领域的应用存在取材不便利、价格昂贵的缺点，并且不能完美预测患者的免疫治疗疗效。
4、综上所述，虽然胶质瘤dc疫苗被证明对于胶质瘤患者而言具有良好的疗效，但并非所有胶质瘤患者均能很好地响应于胶质瘤dc疫苗，而考虑到胶质瘤dc疫苗的治疗成本昂贵，为了能够提高胶质瘤dc疫苗的治疗靶向性，目前市面上亟需可准确预测胶质瘤dc疫苗的免疫疗效以及预后等生物学指标的方案。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒及应用，通过检测胶质瘤患者体内特定的肿瘤标志物蛋白的表达量以精准预测dc疫苗的疗效，便于筛选胶质瘤dc疫苗的潜在受益人群。
2、为实现以上目的，本技术方案提供了一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，包括：
3、蛋白抗体：urgcp蛋白抗体、heatr1蛋白抗体、egfr蛋白抗体以及ntrk蛋白抗体的至少一种；样品稀释液；生物素抗体；hrp-结合剂；洗涤缓冲液；显色液；停止溶液。
4、在一些实施例中，本技术方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒用于对胶质瘤dc疫苗的免疫效果进行预测。具体的，该用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒用于检测待试者体内的urgcp蛋白、heatr1蛋白、egfr蛋白以及ntrk蛋白的表达量，urgcp蛋白、heatr1蛋白、egfr蛋白以及ntrk蛋白的表达量同胶质瘤dc疫苗的免疫效果成正比。
5、本技术团队通过分析胶质瘤样本转录组、蛋白组转录组等测序数据，发现urgcp、heatr1、egfr以及ntrk在恶性胶质母细胞瘤高表达，进一步通过a2b5磁珠分选发现urgcp、heatr1、egfr以及ntrk在a2b5阳性的胶质瘤干细胞比a2b5阴性的胶质瘤肿瘤细胞的表达量更高，故本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，特别适用于a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗的免疫疗效的预测，此处所指代的a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗对应于本技术团队申请的cn101481677b中提到的dc疫苗。
6、a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗是针对于a2b5阳性的胶质瘤干细胞开发得到的，该a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗特别针对于a2b5阳性胶质瘤干细胞，具有更强的自我更新、侵袭性、耐药性和复发能力，可通过精确靶向这些a2b5阳性胶质瘤干细胞以更有效地根除肿瘤的根源，进而减少复发风险，由于a2b5阳性的胶质瘤干细胞相比于a2b5阴性的肿瘤细胞富集更多的肿瘤抗原具备更强的免疫原性，临床上也已经证明了该a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗能够延长胶质瘤患者的总生存期并改善胶质瘤患者的预后。
7、具体而言，本技术团队对于胶质瘤患者的肿瘤样本、血样进行检测分析后发现胶质瘤患者体内均会高表达urgcp、heatr1、egfr以及ntrk蛋白，而打了疫苗的疫苗组患者中，urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量与患者预后呈正相关，高表达urgcp、heatr1、egfr以及ntrk蛋白的患者总生存期更长，故本方案选择以urgcp、heatr1、egfr以及ntrk蛋白是a2b5阳性的胶质瘤干细胞制备dc疫苗的作用靶标，并设计用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，以提前预测胶质瘤患者对于胶质瘤dc疫苗的治疗反应性，从而筛选出潜在的生存获益人群。
8、本技术团队通过合成、筛选urgcp、heatr1、egfr以及ntrk具有免疫原性的肽段，并基于urgcp、heatr1、egfr以及ntrk具有免疫原性的肽段以研制靶向urgcp、heatr1、egfr以及ntrk活性肽段的dc疫苗，该靶向urgcp、heatr1、egfr以及ntrk活性肽段的dc疫苗能够诱导配对的cd8阳性t细胞的显著激活，分泌足量的γ型干扰素。在动物实验中，相较于对照组，靶向urgcp、heatr1、egfr以及ntrk活性肽段的dc疫苗能够显著延长小鼠的总生存期。
9、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，样品稀释液包括10mm磷酸盐缓冲液(pbs,ph值7.4)或0.9％ nacl，作用是溶解、稀释蛋白标准品。
10、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，生物素抗体包括生物素耦连靶向urgcp、heatr1、egfr、ntrk蛋白的抗体，作用是特异性结合待测目标蛋白的物质。
11、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，酶联二抗包括碱性磷酸酶标记的二抗或过氧化物酶标记的二抗，作用是结合生物素标记的抗体。
12、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，洗涤缓冲液包括10mm磷酸盐缓冲液(pbs,ph值7.4)、150mm nacl、0.05％ tween 20，作用是用于清洗反应板上的非特异性结合物质，提高试验的特异性。
13、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，显色液包括反应底物a和反应底物b，作用是与碱性磷酸酶或过氧化物酶反应。
14、在本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒中，停止溶液包括碱性磷酸酶终止剂：3m naoh或过氧化物酶终止剂：3m hcl或3mh2so4，作用是终止酶促反应，使颜色变化不再进行。
15、本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，用于检测胶质瘤患者的urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量，其中urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量同该用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的免疫效果呈正比。换言之，若urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量的表达量越高，则表示当前胶质瘤患者对于胶质瘤dc疫苗的免疫效果以及预后效果更好。
16、优选的，当urgcp的表达量大于5.9ng/ml，亦或者heatr1的表达量大于63.5ng/ml，则表示该患者对于胶质瘤dc疫苗的免疫效果和预后效果更佳。进一步对疫苗组患者数据分析发现，血清urgcp含量大于等于5.9ng/ml，heatr1表达量大于等于63.5ng/ml，患者受益程度更高，分组后的生存差异最为明显。
17、本方案使用酶联免疫吸附法(elisa)法检测urgcp以及heatr1的表达量。具体的，将urgcp蛋白抗体和heatr1蛋白抗体结合到固相载体上，随后取胶质瘤患者的待测样本并将待测样本同生物素化抗体加入到固相载体上，加入hrp-结合试剂并孵育一段时间，随后利用洗涤缓冲液洗涤固相载体并向固相载体中添加显色液孵育一段时间，再加入停止溶液停止反应并测量urgcp以及heatr1的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值自表达量－od值标准曲线中获取urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量。
18、为了搭建urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量－od值标准曲线，本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，还包括：蛋白标准品：已知浓度的urgcp蛋白标准品，已知浓度的heatr1蛋白标准品，已知浓度的egfr蛋白标准品以及已知浓度的ntrk蛋白标准品。
19、此时，关于urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量－od值标准曲线的构建方法如下：配置不同浓度的urgcp蛋白标准品、不同浓度heatr1蛋白标准品、不同浓度的egfr蛋白标准品以及不同浓度的ntrn蛋白标准品，将不同浓度的urgcp蛋白标准品、不同浓度heatr1蛋白标准品、不同浓度的egfr蛋白标准品以及不同浓度的ntrn蛋白标准品结合到固相载体上，加入hrp-结合试剂并孵育一段时间，随后利用洗涤缓冲液洗涤固相载体并向固相载体中添加显色液孵育一段时间，再加入停止溶液停止反应并测量urgcp以及heatr1的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值和urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的浓度构建对应的表达量－od值标准曲线。
20、在一些实施例中，可在利用该用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒对待测患者进行检测之前，利用已知浓度的urgcp蛋白标准品、已知浓度heatr1蛋白标准品、已知浓度的已知浓度的egfr蛋白标准品以及已知浓度的ntrk蛋白标准品构建urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量－od值标准曲线，并在相同条件下对待测患者进行检测。
21、在另一些实施例中，可直接获取urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量－od值标准曲线，并在相同条件下对待测患者进行检测。
22、另外，本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒可用于检测胶质瘤患者的血清、组织匀浆、尿液、唾液及其他液体生物样本。
23、若检测的是胶质瘤患者的血清，此时，取胶质瘤患者的血液并加入血清分离胶一段时间，随后在低温环境下离心收集血清。在一些具体实施例中，使用含有血清分离胶的试管采集胶质瘤患者的血液，让血液在室温下凝结2小时或在4℃下过夜，然后在4℃下以2500-3500×g离心20分钟。收集血清，立即进行检测，否则存放在-20℃或-80℃并避免重复的冻融循环。
24、若检测的是胶质瘤患者的组织匀浆，此时，取胶质瘤患者的组织样本并加入添加有的蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液中进行组织匀浆，离心收集组织匀浆。在一些具体实施例中，获取胶质瘤患者的组织样本，在冰浴中用预冷的0.01mph7.4 pbs(添加蛋白酶抑制剂)进行组织匀浆，建议组织重量与pbs体积的比例为1:9，即1克组织应加入9毫升pbs，收集匀浆液，4℃下以10000×g离心10分钟。然后收集上清液立即进行检测，否则，存放在-20℃或-80℃并避免重复的冻融循环。
25、若检测的是胶质瘤患者的尿液、唾液及其他液体生物样本，此时，取胶质瘤患者的尿液、唾液及其他液体生物样本进行离心收集上清液。在一些具体实施例中，获取胶质瘤患者的尿液、唾液及其他液体生物样本，在4℃下以3000×g离心10分钟。然后收集上清液，立即进行检测，否则，存放在-20℃或-80℃并避免重复的冻融循环。
26、第二方面，本方案提供了一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的应用方法，应用于对胶质瘤dc疫苗的免疫效果进行预测以筛选潜在受益人群。
27、具体的，该用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的应用方法包括步骤：获取胶质瘤患者的待测样本，基于用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒利用酶联免疫吸附法法检测待测样本中的urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值自表达量－od值标准曲线中获取urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量。
28、在本方案的实施例中，胶质瘤患者的urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量同胶质瘤dc疫苗的免疫效果以及预后效果呈正比。也就是说，选择urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量大于设定阈值的患者作为胶质瘤dc疫苗潜在受益人群，辅助医生在临床上对这部分潜在受益人群采用胶质瘤dc疫苗的治疗。
29、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
30、本方案结合dc疫苗的临床试验结果，开发了可用于预测dc疫苗的免疫疗效的检测试剂并提供了用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，该检测试剂盒仅需胶质瘤患者的少许检测样本即可进行检测，同时具有运输方便、检测简单、结果准确灵敏等特点，同时，该用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的独立包装设计杜绝出现生物检测生物标志物试剂的污染及损坏，影响检测检测结果。更为重要的是，本方案提供的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒可通过提前检测urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的表达量以精确地筛选胶质瘤dc疫苗的免疫治疗潜在受益人群，从而增强dc疫苗治疗策略，提高胶质瘤dc疫苗的治疗靶向性的同时降低了患者的治疗费用。
1.一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，用于检测待试者体内的urgcp蛋白、heatr1蛋白、egfr蛋白以及ntrk蛋白的表达量，urgcp蛋白、heatr1蛋白、egfr蛋白以及ntrk蛋白的表达量同胶质瘤dc疫苗的免疫效果成正比。
3.根据权利要求1所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，适用于a2b5阳性的胶质瘤干细胞抗原致敏的dc疫苗的免疫疗效的预测。
4.根据权利要求1所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，样品稀释液包括磷酸盐缓冲液或nacl，生物素抗体包括生物素耦连靶向urgcp、heatr1、egfr、ntrk蛋白的抗体，酶联二抗包括碱性磷酸酶标记的二抗或过氧化物酶标记的二抗，洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液、nacl、tween 20，停止溶液包括碱性磷酸酶终止剂或过氧化物酶终止剂。
5.根据权利要求1所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，使用酶联免疫吸附法检测urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或以上组合的表达量：将urgcp蛋白抗体、heatr1蛋白抗体、egfr蛋白抗体以及ntrk蛋白抗体的任一种或以上组合结合到固相载体上，随后取胶质瘤患者的待测样本并将待测样本同生物素化抗体加入到固相载体上，加入hrp-结合试剂并孵育一段时间，随后利用洗涤缓冲液洗涤固相载体并向固相载体中添加显色液孵育一段时间，再加入停止溶液停止反应并测量urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或以上组合的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或以上组合的od值自表达量－od值标准曲线中获取urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或以上组合的表达量。
6.根据权利要求1所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，包括：蛋白标准品：已知浓度的urgcp蛋白标准品、已知浓度heatr1蛋白标准品、已知浓度的egfp蛋白标准品以及ntrk蛋白标准品的至少一种。
7.根据权利要求6所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒，其特征在于，配置不同浓度的urgcp蛋白标准品、不同浓度heatr1蛋白标准品、不同浓度的egfp蛋白标准品以及不同浓度的ntrk蛋白标准品，将不同浓度的urgcp蛋白标准品、不同浓度heatr1蛋白标准品、不同浓度的egfp蛋白标准品以及不同浓度的ntrk蛋白标准品结合到固相载体上，加入hrp-结合试剂并孵育一段时间，随后利用洗涤缓冲液洗涤固相载体并向固相载体中添加显色液孵育一段时间，再加入停止溶液停止反应并测量urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的od值和urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的浓度构建对应的表达量－od值标准曲线。
8.一种用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的应用方法，其特征在于，获取胶质瘤患者的待测样本，基于权利要求1到7任一所述的用于筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒利用酶联免疫吸附法法检测待测样本中的urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或组合的od值，依据urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或组合的od值自表达量－od值标准曲线中获取urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或组合的表达量。
9.根据权利要求8所述的筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的应用方法，其特征在于，待测样本选择为胶质瘤患者的血清、组织匀浆、尿液、唾液及其他液体生物样本的一种。
10.根据权利要求8所述的筛选胶质瘤dc疫苗潜在受益人群的试剂盒的应用方法，其特征在于，选择的urgcp、heatr1、egfr以及ntrk的任一种或组合的表达量大于设定阈值的患者作为胶质瘤dc疫苗潜在受益人群。
