本发明涉及医学检验，特别涉及一种基于spytag/spycatcher的免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
背景技术：
1、免疫层析试纸条（lateral flow immunoassays，lfia）是一种将免疫标记技术和层析技术相结合的快速检测方法，由于其快速、经济、便携等优势而被广泛应用于疾病早期筛查应用及床旁检测。该方法依赖于抗原-抗体识别反应，然而，探针免疫复合物在检测线上涌动的过程属于瞬时反应，且抗原-抗体反应亲和力弱（非共价键，亲和力kd为~10-9m），导致检测线对探针免疫复合物的捕获效率较低（<5%），即便使用更高信号强度的标记探针也无法将检测灵敏度提升到理想水平，限制了试纸条检测灵敏度的提升。
2、因此，现有技术仍有待于改进和发展。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于spytag/spycatcher的免疫层析试纸条及其制备方法与应用，旨在解决现有免疫层析试纸条灵敏度有限的问题。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明的第一方面，提供一种基于spytag/spycatcher的免疫层析试纸条，包括：反应物和检测试纸条；
4、所述反应物包括信号标记物和二抗@ spytag偶联物；
5、其中，所述信号标记物包括标记探针和修饰在所述标记探针上的一抗；所述二抗@spytag偶联物包括spytag多肽和偶联在所述spytag多肽上的二抗；所述一抗和所述二抗为针对同一生物标志物不同抗原表位的两种抗体；
6、所述检测试纸条包括底板以及在所述底板上依次搭接的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
7、其中，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有spycatcher蛋白，所述质控线上包被有质控抗体。
8、优选的技术方案，所述信号标记物中，所述标记探针和所述一抗的质量比为1︰（0.08-0.12）。
9、优选的技术方案，所述标记探针选自量子点荧光微球或聚集诱导发光荧光微球。
10、优选的技术方案，所述二抗@ spytag偶联物中，所述spytag多肽和所述二抗的摩尔比为（0.5-2）︰1；所述spytag多肽和所述二抗通过抗fc片段的纳米抗体偶联。
11、优选的技术方案，所述spytag多肽和所述抗fc片段的纳米抗体通过氨基酸柔性桥梁连接。
12、优选的技术方案，所述spytag多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述spycatcher蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述抗fc片段的纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述氨基酸柔性桥梁的氨基酸序列如seq id no.7所示。
13、优选的技术方案，所述信号标记物的含量为0.05-1μg；所述二抗@ spytag偶联物的含量为0.001-0.01μg。
14、优选的技术方案，所述spycatcher蛋白的包被量为0.5-2μl/cm，所述质控抗体的包被量为0.5-2μl/cm。
15、优选的技术方案，所述质控抗体选自羊抗鼠igg抗体、羊抗兔igg抗体中的一种。
16、本发明的第二方面，提供一种如第一方面所述的免疫层析试纸条的制备方法，包括：
17、反应物的制备：合成信号标记物和二抗@ spytag偶联物，冻干保存；
18、检测试纸条的制备：在底板上依次搭接样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，裁剪后与卡壳组装，形成检测试纸条。
19、本发明的第三方面，提供一种如第一方面所述的免疫层析试纸条在生物标志物检测中的应用。
20、优选的技术方案，所述生物标志物为所有疾病相关蛋白。
21、有益效果：本发明通过将spytag/spycatcher体系与试纸条的整合，将传统试纸条检测线上抗原-抗体的瞬时反应转移至固定的反应体系中，通过延长免疫信号标记物和目标生物标志物的反应时间以增加反应效率得到更多的免疫复合物。免疫复合物通过毛细作用力涌动至检测线时，再通过spytag/spycatcher识别作用而被捕获。相较于传统弱亲和力的抗原-抗体反应，spytag/spycatcher为不可逆的共价结合，反应亲和力接近无限，且反应时间快，可大大提高检测线对免疫复合物的捕获效率，从而显著提升试纸条检测灵敏度。该方法制备的试纸条相较传统试纸条方法不改变操作步骤或牺牲检测时间，为高灵敏度疾病标志物检测及疾病早期筛查提供了新方法。
1.一种基于spytag/spycatcher的免疫层析试纸条，其特征在于，包括：反应物和检测试纸条；
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述信号标记物中，所述标记探针和所述一抗的质量比为1︰（0.08-0.12）；
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述二抗@ spytag偶联物中，所述spytag多肽和所述二抗的摩尔比为（0.5-2）︰1；所述spytag多肽和所述二抗通过抗fc片段的纳米抗体偶联。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述spytag多肽和所述抗fc片段的纳米抗体通过氨基酸柔性桥梁连接。
5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述spytag多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述spycatcher蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述抗fc片段的纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述氨基酸柔性桥梁的氨基酸序列如seqid no.7所示。
6.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述反应物中，所述信号标记物的含量为0.05-1μg；所述二抗@ spytag偶联物的含量为0.001-0.01μg。
7.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述spycatcher蛋白的包被量为0.5-2μl/cm，所述质控抗体的包被量为0.5-2μl/cm；
8.一种如权利要求1-7任一项所述的免疫层析试纸条的制备方法，包括：
9.一种如权利要求1-7任一项所述的免疫层析试纸条在生物标志物检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为所有疾病相关蛋白。
