本发明涉及一种制备多腔室蛋白纳米结构的纳米雕刻方法，属于食品结构调控与功能定制。
背景技术：
1、多腔室结构是细胞实现对复杂生物过程实施精准时空调控的关键。近年来，探索模仿活体细胞的复杂结构已经成为超分子催化领域到合成生物学领域的共同目标。同时，分隔开的纳米腔室可以确保活性物质的独立存在，并能有效调节微环境中分子的进出方向及速率，因而在食品和生物医药领域亦备受关注。
2、在制备技术的开发方面，现有的模板法和微流控法能够实现基于脂质和高分子聚合物的多腔室纳米结构的开发。然而，该过程中涉及的化学物质和人工合成高分子的具有潜在的食品安全隐患，限制了它们在食品、药品及化妆品等领域的应用。此外，目前鲜有构建多腔室蛋白纳米结构(50-500nm)的研究。
技术实现思路
1、针对当前对多腔室蛋白纳米结构的需求以及现有制备方法中的技术缺陷(如结构的低调控精度及原材料的食品安全隐患)，本发明提供了一种制备多腔室蛋白纳米结构的纳米雕刻方法。该方法操作简便、高效，且所使用的原料与反应试剂均为食品级。该方法可以利用天然蛋白作为原料，制备出具有良好生物相容性的多腔室蛋白纳米结构。此外，通过调整共架蛋白的比例，可以调节内部腔室的数量(8.3～21.4)和腔室体积(4.31～33.49nm3)，从而控制内部营养物/药物负载率和释放率。因此，该方法在营养物/药物精准可控递送领域具有潜在应用。
2、本发明以由是醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白醇不溶性亲水蛋白所形成的共架蛋白为基础，借助相似相容原理实现醇相对于共架蛋白的向心扩散，进而通过蛋白梯度扩散作用去除共架蛋白中醇溶性的蛋白组分，最终形成具有乙醇核-蛋白壳的核-壳结构并首次在纳米尺度上实现蛋白结构的纳米雕刻。其后，通过透析作用在醇浓度梯度作用下将乙醇从核-壳纳米结构内部透析去除，从而形成具有多腔室结构的共架蛋白纳米颗粒。此外，通过调整醇溶蛋白在共架蛋白中所占的比例，可在纳米雕刻过程中去除不同比例的醇溶蛋白，实现对共架蛋白颗粒的差异化纳米雕刻，并形成具有差异腔室数量和腔室体积的蛋白纳米颗粒。
3、本发明的目的是提供一种制备多腔室蛋白纳米结构的纳米雕刻方法，所述方法具体包括如下步骤：
4、(1)分别将醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白分散于水中，调节ph至10.0～12.0，搅拌、离心，取上层分散液，分别制备得到醇溶性疏水蛋白溶液和醇不溶性亲水蛋白溶液；
5、(2)将步骤(1)制备得到的醇溶性疏水蛋白溶液和醇不溶性亲水蛋白溶液混匀后，调节ph至中性，离心，即得到共架蛋白纳米颗粒分散液；
6、(3)将装有乙醇溶液的透析装置置于步骤(2)得到的共架蛋白纳米颗粒分散液中进行透析，透析结束后，取出透析装置，将经透析后的共架蛋白纳米颗粒分散液离心去除沉淀，即得到具有乙醇内核、蛋白外壳的核-壳蛋白纳米结构分散液；
7、(4)将步骤(3)得到的核-壳蛋白结构分散液和乙醇溶液混合后置于透析装置中，将所述透析装置置于水溶液中进行透析，透析结束后，将透析装置中的混合液离心，取上层分散液冷冻干燥，即得具有多腔室结构的蛋白纳米颗粒。
8、在一种实施方式中，步骤(1)所述醇溶蛋白粉包括玉米醇溶蛋白粉、小麦醇溶蛋白粉、高粱醇溶蛋白粉中的一种或多种。
9、在一种实施方式中，步骤(1)所述醇不溶疏水蛋白粉包括核桃蛋白粉、大米蛋白粉、麦谷蛋白粉中的一种或多种。
10、在一种实施方式中，步骤(1)所述蛋白粉与水的质量体积比为1：50～100,g/ml。
11、在一种实施方式中，步骤(1)所述调节ph是采用1～5mol/l的naoh溶液进行调节。
12、在一种实施方式中，步骤(1)所述离心条件为10,000～15,000g离心10～15min。
13、在一种实施方式中，步骤(2)所述调节ph是采用1～5mol/l的hcl溶液进行调节。所述中性是指ph为：7.0。
14、在一种实施方式中，步骤(2)所述离心条件为10,000～15,000g离心10～15min。
15、在一种实施方式中，步骤(3)中，所述透析装置中，还可以加入吐温80；
16、在步骤(3)透析所用乙醇水溶液中加入吐温80，稳定蛋白质，抑制聚集；然后将透析后得溶液离心，弃去沉淀，即得均一的核壳结构共架蛋白纳米颗粒分散液。
17、在一种实施方式中，所述吐温80的添加量，按照乙醇的体积计算，添加量为：0.1％～0.5％(v/v)。
18、在一种实施方式中，所述吐温80在透析液中的终浓度为1～10mg/ml。
19、在一种实施方式中，所述吐温80的体积分数为：0.5％；即：体积分数为1％的乙醇水溶液中加入体积分数为0.5％的吐温80，按照1000：1(v/v)的比例混合后配制成浓度为0.1％的乙醇-吐温80水溶液(1000ml乙醇中添加了1ml吐温)。
20、在一种实施方式中，步骤(3)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)。
21、在一种实施方式中，步骤(4)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)
22、在一种实施方式中，步骤(3)所用透析液中乙醇的终浓度为50～250mg/ml。
23、在一种实施方式中，步骤(3)所述透析时间为12～24h。
24、在一种实施方式中，步骤(3)所述离心条件为4,000～5,000g离心10～15min。
25、在一种实施方式中，步骤(4)所述透析时间为12～24h。
26、在一种实施方式中，步骤(3)所述离心条件为4,000～5,000g离心10～15min。
27、在一种实施方式中，随着步骤(1)所述两种蛋白分散液的混合体积比(醇溶蛋白：醇不溶疏水蛋白)从1:0.01减小至1:100(ml/ml)，所得共架蛋白纳米颗粒的多腔室结构特征由少数量、大体积转变为多数量、小体积。
28、本发明还提供一种由上述所述的纳米雕刻方法制备得到蛋白纳米颗粒，所述的蛋白纳米颗粒具有数量和体积可控的多腔室结构。
29、本发明还提供了一种装载疏水药物的多腔室结构的蛋白纳米颗粒缓释制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
30、(1)分别将醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白分散于水中，调节ph至10.0～12.0，搅拌、离心，取上层分散液，分别制备得到醇溶性疏水蛋白溶液和醇不溶性亲水蛋白溶液；
31、(2)将步骤(1)制备得到的醇溶性疏水蛋白溶液和醇不溶性亲水蛋白溶液混匀后，调节ph至中性，离心，即得到共架蛋白纳米颗粒分散液；
32、(3)向乙醇溶液中添加疏水药物后得到混合液，将混合液置于透析装置中，将所述透析装置置于步骤(2)得到的共架蛋白纳米颗粒分散液中进行透析，透析结束后，取出透析装置，将经透析后的共架蛋白纳米颗粒分散液离心去除沉淀，即得到具有乙醇-黄连素内核、蛋白外壳的核-壳蛋白纳米结构分散液；
33、(4)将步骤(3)得到的核-壳蛋白结构分散液和乙醇-疏水药物溶液混合后置于透析装置中，将所述透析装置置于水溶液中进行透析，透析结束后，将透析装置中的混合液离心，取上层分散液冷冻干燥即得蛋白纳米颗粒缓释制剂；所述乙醇-疏水药物溶液的制备方法为：在乙醇水溶液中加入疏水药物后配制得到。
34、在发明的一种实施方式中，所述疏水药物包括但不限于：黄连素、紫杉醇、维生素d；
35、优选的，步骤(3)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)；步骤(4)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)；
36、优选的，步骤(3)中，所述透析装置中，还可以加入吐温80，所述吐温80的添加量终浓度为1～10mg/ml；
37、优选的，所述醇溶性疏水蛋白包括不限于：玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白；所述醇不溶性亲水蛋白包括不限于：核桃蛋白、大豆蛋白或酪蛋白。
38、在发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中透析时间为12～24h；优选的，步骤(4)中透析时间为12～24h；
39、优选的，步骤(2)中所述醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白是按照体积比为1:0.01～100进行混合的；
40、优选的，步骤(1)中，所述醇溶性疏水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中，所述醇不溶性亲水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中。
41、本发明还提供一种由上述所述的纳米雕刻方法或所述的蛋白纳米颗粒在制备营养物/药物载体中的应用途径。
42、有益效果
43、(1)本发明方法操作简便、高效，利用天然蛋白为原料制备出具有良好生物相容性的多腔室蛋白纳米颗粒，所使用的原料与反应试剂均为食品级。此外，通过调整共架蛋白的比例，可以调节内部腔室的数量和体积，从而控制内部营养物/药物负载率和释放率。因此，本发明方法在营养物/药物精准可控递送领域具有潜在应用。
44、(2)目前，尚未有关于天然蛋白“纳米雕刻术”的研究与报道，本发明以由醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白所组成的共架蛋白纳米颗粒为基础，借助相似相容原理实现醇相对于共架蛋白的向心扩散，进而通过蛋白梯度扩散作用去除共架蛋白中醇溶性的蛋白组分，最终形成具有乙醇核-蛋白壳的核-壳结构并首次在纳米尺度上实现蛋白结构的纳米雕刻。其后，通过透析作用在醇浓度梯度作用下将乙醇从核-壳纳米结构内部透析去除，从而形成具有多腔室结构的共架蛋白纳米颗粒。
45、(3)此外，通过调整醇溶蛋白在共架蛋白中所占的比例，可在纳米雕刻过程中去除不同比例的醇溶蛋白，实现对共架蛋白颗粒的差异化纳米雕刻，并形成具有差异腔室数量和腔室体积的蛋白纳米颗粒，扩大其应用范围和价值。
1.一种制备多腔室蛋白纳米结构的纳米雕刻方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的纳米雕刻方法，其特征在于，步骤(3)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)；步骤(4)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)。
3.根据权利要求1或2所述的纳米雕刻方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析装置中，还可以加入吐温80，所述吐温80的添加量，按照乙醇的体积计算，添加量为：0.1％～0.5％(v/v)。
4.根据权利要求1～3任一所述的纳米雕刻方法，其特征在于，所述醇溶性疏水蛋白包括玉米醇溶蛋白粉、小麦醇溶蛋白粉、高粱醇溶蛋白粉中的一种或多种；所述醇不溶性亲水蛋白包括核桃蛋白粉、大米蛋白粉、麦谷蛋白粉中的一种或多种。
5.根据权利要求1～4任一所述的纳米雕刻方法，其特征在于，步骤(3)中透析时间为12～24h；优选的，步骤(4)中透析时间为12～24h；优选的，步骤(2)中所述醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白是按照体积比为1:0.01～100进行混合的；优选的，步骤(1)中，所述醇溶性疏水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中，所述醇不溶性亲水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中。
6.权利要求1～5任一所述的纳米雕刻方法制备得到的具有多腔室结构的蛋白纳米颗粒。
7.一种装载疏水药物的多腔室结构的蛋白纳米颗粒缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述疏水药物包括但不限于：黄连素、紫杉醇、维生素d；优选的，步骤(3)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)；步骤(4)中的乙醇溶液的浓度为1％(v/v)～6％(v/v)；优选的，步骤(3)中，所述透析装置中，还可以加入吐温80，所述吐温80的添加量，按照乙醇的体积计算，添加量为：0.1％～0.5％(v/v)；优选的，所述醇溶性疏水蛋白包括不限于：玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白；所述醇不溶性亲水蛋白包括不限于：核桃蛋白、大豆蛋白或酪蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中透析时间为12～24h；优选的，步骤(4)中透析时间为12～24h；优选的，步骤(2)中所述醇溶性疏水蛋白和醇不溶性亲水蛋白是按照体积比为1:0.01～100进行混合的；优选的，步骤(1)中，所述醇溶性疏水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中，所述醇不溶性亲水蛋白是按照质量体积比为1:50～100的比例分散于水中。
10.权利要求1～5任一所述的纳米雕刻方法或权利要求6所述的蛋白纳米颗粒或权利要求7～9任一所述的制备方法在制备营养物、药物纳米载体中的应用。
