本发明涉及一种琥珀酸发酵合成菌，属于生物工程领域。
背景技术：
1、琥珀酸是一种四碳二羧酸，含有两个羧基与两个亚甲基，具有二元脂肪酸的特性；同时位于羧基内的两个亚甲基较为活泼，能够与其他活性较强的基团发生反应，生成多种多样的琥珀酸衍生物。琥珀酸可用于合成多种重要化工产品，例如丁二醇，四氢呋喃等；也可以用于合成环境友好型的可降解高分子材料——聚丁烯琥珀酸酯(pbs)、聚酰胺等；琥珀酸既能作为底物合成传统且重要的单体有机化合物，也能用于合成环保的不同作用的高分子材料等。因此，琥珀酸因其生物基平台化合物的特性，在食品，农药，医药，香料，染料，油漆，塑料等工业中有着广泛的应用，具有极高的应用价值。如果能提高其发酵生产效率、降低制备成本，琥珀酸将在未来取代化石燃料的衍生物，成为一种使用价值大、应用前景更广的生物基中间体。
2、近年来，构建大肠杆菌(escherichia coli)细胞工厂，利用可再生资源高效制备琥珀酸越来越受到关注。然而，实验室用于基因克隆、表达的大肠杆菌工具菌株往往经过多次基因编辑，去除了多种限制、修饰系统，导致菌体生长速率和对环境的适应能力都显著低于野生型菌株，不利于工业化应用。从自然界中筛选生长速率更高、不具有抗生素抗性的野生型大肠杆菌作为出发菌株，进一步利用代谢工程策略改造其代谢途径构建高效发酵合成琥珀酸的重组大肠杆菌，将有利于进一步提高琥珀酸工业发酵性能。磷酸烯醇式丙酮酸固定co2合成草酰乙酸是合成琥珀酸途径中最关键的反应，有研究通过优化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)的表达水平，可将琥珀酸产量提高37.5％(《current advances of succinate biosynthesis in metabolically engineeredescherichia coli》)。通过引入来源于根瘤菌或者乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶(pyc)也可以促进丙酮酸固定co2转化成草酰乙酸，有效提高了琥珀酸得率和产量(《琥珀酸发酵菌种研究进展》)。琥珀酸脱氢酶(frdabcd)是催化合成琥珀酸的末端途径，然而有研究发现强化其编码基因不利于厌氧琥珀酸的产生(《代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺》)；在强化了前端co2固定途径基础上，再强化该代谢途径也有助于促进琥珀酸合成(《协同优化大肠杆菌代谢途径发酵合成琥珀酸》,中国科技论文在线,2024)。为了减少琥珀酸合成前体物质磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，磷酸烯醇式丙酮酸/糖磷酸转运系统(pts)常被阻断，导致葡萄糖利用能力降低。通过在ptsg突变的e.coli菌株中过量表达半乳糖转运蛋白(galp)，或者优化葡萄糖激酶(glk)和galp的表达，也可有效提高琥珀酸得率(《metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate productionin escherichia coli》)。对多个代谢途径的协同改造，以达到代谢途径配比最优化与最适化，将有利于进一步提高琥珀酸产能。
3、大肠杆菌代谢过程中，琥珀酸可通过乙醛酸循环、tca循环和tca还原支路(r-tca)合成。乙醛酸循环和tca循环合成琥珀酸的得率低，但是可以积累还原性nadh；rtca途径合成琥珀酸的得率高，但是需要消耗nadh。还原力水平达到平衡时，大肠杆菌合成琥珀酸的最大理论得率为1.71mol/mol葡萄糖(即1.124g/g葡萄糖)。因此，根据细胞内还原力水平，动态平衡还原力，有望合理分配代谢流，提高琥珀酸得率及底物的利用效率。
技术实现思路
1、本发明提供了大肠杆菌s15，已于2024年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.30887，该菌株具有抗噬菌体、抗高渗透压性能。
2、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌在出发菌株的基础上具有如下改进：
3、(1)降低了竞争代谢途径基因的表达，强化琥珀酸合成代谢途径及糖摄取代谢途径；
4、(2)动态调控还原力水平合成琥珀酸；
5、所述出发菌株为所述大肠杆菌s15。
6、在一种实施方式中，所述降低竞争代谢途径基因的表达是敲除大肠杆菌竞争代谢途径基因：乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶acka-pta、乙醇脱氢酶基因adhe、乳酸脱氢酶基因ldha、乙醛酸循环的抑制因子iclr、催化磷酸烯醇式丙酮酸合成丙酮酸基因ptsg、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb、丙酮酸氧化酶基因poxb、d-乳酸脱氢酶基因dld、丙酮醛合成酶mgsa、和l-乳酸脱氢酶基因lldd，获得的菌株命名为s15-100。
7、在一种实施方式中，所述琥珀酸合成代谢途径包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和和富马酸还原酶基因frda。
8、在一种实施方式中，所述糖摄取代谢途径包括半乳糖转运蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk。
9、在一种实施方式中，将所述菌株s15-100染色体上的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc(gene id:948457)和富马酸还原酶基因frda(gene id:948667)的启动子分别替换为j23100强启动子，获得的菌株命名为s15-120；所述j23100强启动子的核苷酸序列如seq idno.5所示。
10、在一种实施方式中，在菌株s15-120的sdhd基因(琥珀酸脱氢酶)后融合表达laa降解标签(核苷酸序列如seq id no.9所示)，弱化该基因的表达，获得的菌株命名为s15-130。
11、在一种实施方式中，将菌株s15-130的半乳糖转运蛋白基因galp(gene id:947434)和葡萄糖激酶基因glk(gene id:946858)的启动子分别替换为p20启动子，获得的菌株命名为s15-150；所述p20启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌中还引入了rex还原力感应调控系统，所述rex还原力感应调控系统包括操纵基因ip和调节基因rex；所述操纵基因ip设置在目标基因上游并与目标基因共享启动子；所述调节基因rex整合在基因组上表达或在质粒上表达。
13、在一种实施方式中，所述调节基因rex的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述操纵基因ip的核苷酸序列如seq id no.7所示。
14、在一种实施方式中，所述调节基因rex在质粒pb-4上表达，所述操纵基因ip分别设置在所述基因ppsa和基因pyc的上游。
15、在一种实施方式中，用j23100启动子调控染色体基因ppsa的表达，用ptrc启动子调控质粒上pyc基因的表达。
16、本发明还提供了一种发酵生产琥珀酸的方法，所述方法是将所述重组大肠杆菌在发酵培养基中进行好氧-厌氧两阶段发酵；好氧阶段是在35～37℃、150～250r/min培养一段时间，再在厌氧环境中密封培养。
17、在一种实施方式中，在摇瓶环境下，好氧发酵至od600达到2.5转入厌氧发酵。
18、在一种实施方式中，在发酵罐环境下，好氧发酵至od600达到50转入厌氧发酵。
19、在一种实施方式中，发酵过程控制ph为7.0±0.2。
20、在一种实施方式中，好氧发酵阶段控制溶解氧浓度大于40％，培养温度为37±0.5℃。溶解氧浓度突然升高时，补加100ml浓度为800g/l葡萄糖；当od600值达到50时，转入厌氧发酵阶段，添加0.5g甜菜碱，并补充800g/l葡萄糖维持残糖浓度大于1g/l。
21、本发明还提供所述重组大肠杆菌或所述方法在生产含琥珀酸的产品中的应用。
22、有益效果：
23、(1)本发明筛选到一株野生型大肠杆菌s15菌株，其菌体生长量和比生长速率分别比菌株b0016提高了38.7％和4.5％。同时，该菌株不具有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素抗生素抗性，可以作为基因改造的出发菌株用于构建高效发酵合成目标产品的工程菌株。
24、(2)菌株s15对t1、t7和w2噬菌体具有抗性，不能被这3种噬菌体裂解；菌株s15在20g/l nacl和30g/l nacl的培养基中生长能力均高于菌株b0016。抗噬菌体和抗渗透压能力增强，有利于在大规模工业发酵过程中抵抗噬菌体污染和高浓度代谢产物引起的代谢压力，以实现高效工业发酵生产。
25、(3)本发明在菌株s15中，通过强化了琥珀酸合成代谢途径、敲除或者弱化琥珀酸竞争代谢途径、强化葡萄糖摄取代谢途径，使得琥珀酸的摇瓶发酵产量提高为40.2g/l，得率提高为1g/g葡萄糖。进一步构建获得的动态平衡细胞还原力水平的重组菌株s15-160c/prex-b-4，在5l发酵罐中进行好氧-厌氧两阶段发酵，菌体生长至od600值达到50的时间比文献报道缩短12.5％，有利于降低菌体生长阶段通气、搅拌等能耗，降低生产成本。该菌株发酵120h的琥珀酸产量达到146.3g/l，比目前利用大肠杆菌发酵合成琥珀酸的最高产量(139.6g/l)提高了4.8％；得率达到1.1g/g葡萄糖，接近理论得率，具有较好的工业应用潜力。
26、大肠杆菌s15，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)，已于2024年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.30887，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
1.大肠杆菌s15，已于2024年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.30887。
2.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上具有(a)和/或(b)的改进：
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述降低竞争代谢途径基因的表达敲除如下一个或多个大肠杆菌竞争代谢途径基因：乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶acka-pta、乙醇脱氢酶基因adhe、乳酸脱氢酶基因ldha、乙醛酸循环的抑制因子iclr、催化磷酸烯醇式丙酮酸合成丙酮酸基因ptsg、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb、丙酮酸氧化酶基因poxb、d-乳酸脱氢酶基因dld、丙酮醛合成酶mgsa、和l-乳酸脱氢酶基因lldd。
4.根据权利要求2或3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述琥珀酸合成代谢途径包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和富马酸还原酶基因frda；所述糖摄取代谢途径包括半乳糖转运蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和富马酸还原酶基因frda的启动子分别替换为j23100强启动子；所述j23100强启动子的核苷酸序列如seq id no.5所示。
6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在琥珀酸脱氢酶基因sdhd下游融合表达laa降解标签弱化基因表达。
7.根据权利要求4～6任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，将所述半乳糖转运蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk的启动子分别替换为p20启动子；所述p20启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.根据权利要求2～7任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还引入了rex还原力感应调控系统，所述rex还原力感应调控系统包括操纵基因ip和调节基因rex；所述调节基因rex的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述操纵基因ip的核苷酸序列如seq id no.7所示。
9.一种发酵生产琥珀酸的方法，其特征在于，将权利要求2～8任一所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行好氧-厌氧两阶段发酵；好氧阶段是在35～37℃、150～250r/min培养至od600达到2.5，再在厌氧环境中培养。
10.权利要求2～8任一所述的重组大肠杆菌或权利要求9所述的方法在生产琥珀酸或含琥珀酸的产品中的应用。
