本发明涉及电化学生物检测，特别涉及一种利用方波伏安法检测循环肿瘤dna的方法。
背景技术：
1、据世界卫生组织统计，肿瘤是全球第二大死因，每年全球近六分之一的死亡由肿瘤造成。既往研究表明，早期诊断和筛查可显著降低恶性肿瘤的死亡率。血液检查是检测恶性肿瘤的一种方法，其具有许多优点，如无创性、实时性、长期性和快速性。然而，常用的肿瘤生物标志物如血清癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)和糖类抗原等存在敏感性和特异性差等缺点。
2、游离dna(circulating free dna or cell free dna，cfdna)，循环游离dna或者细胞游离dna，是释放到血浆中的降解的dna片段。cfdna存在于人体的各种体液中，随组织损伤、肿瘤和炎症反应等发生浓度变化。肿瘤患者血浆内循环肿瘤细胞释放或原位肿瘤细胞释放入循环的cfdna也称ctdna，ctdna可以作为血液活检标志物，在恶性肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后评估中发挥重要作用。
3、ctdna的临床检测方法主要是基于pcr的检测方法，包括甲基化特异性pcr、甲基化定量pcr、数字微滴pcr和高通量测序技术，检测步骤复杂，成本较高。提供一种快速、灵敏、经济、简便，并且具有转化为现场检测的潜力的检测方法具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种检测循环肿瘤dna的方法。
2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
3、本发明提供一种检测循环肿瘤dna方法，包括以下步骤：
4、将待测样品溶于缓冲液，得到样品缓冲液；
5、将电化学传感器电极的工作电极于样品缓冲液中孵育，所述工作电极为金电极或具有金涂层的电极；
6、将电化学传感器电极置于电解液中，使用方波伏安法进行电化学信号检测；
7、分析电化学信号。
8、癌症基因组和正常表观基因组的不同溶剂化性质显著影响它们对裸金属表面的亲和力，例如金。dna-金相互作用具有高度的序列依赖性，并且ctdna对金表面具有更高的亲和力。本发明利用ctdna的这一特征，提供一种使用金电极或具有金涂层的电极作为工作电极的电化学传感器，结合方波伏安法检测电化学信号，实现ctdna的检测。本发明中分析电化学信号是指分析待测样品和对照样品的峰值电化学信号并进行对比。所述对照样品的峰值电化学信号是指将对照样品使用与待测样品相同参数的方波伏安法检测得到的峰值电化学信号。本发明中待测样品是指肿瘤患者的游离dna样品，对照样品是指健康人的游离dna样本。本发明中健康人是指不患肿瘤的人。
9、在本发明一些实施方式中，所述缓冲液为ssc缓冲液。
10、在本发明一些实施方式中，所述ssc缓冲液ph＝7。
11、在本发明一些实施方式中，工作电极于样品缓冲液中孵育时长为10至20min，孵育温度为25℃。
12、在本发明一些实施方式中，所述电化学传感器电极还包括参比电极和对电极，所述参比电极为ag/agcl电极，所述对电极为铂电极。
13、在本发明一些实施方式中，所述金电极于样品缓冲液中孵育之前还包括对所述金电极抛光、清洗、干燥的预处理步骤。
14、在本发明一些实施方式中，所述电解液含有二茂铁溶液和氯化钾溶液。
15、在本发明一些实施方式中，所述电解液为1mmol/l二茂铁溶液与0.1mol/l氯化钾溶液混合物。
16、在本发明一些实施方式中，所述方波伏安法的测试参数为：初始电位-0.1v，终止电位0.5-0.6v，电位增量2-5mv，频率25-50赫兹，脉冲电位5-25mv。
17、在本发明一些实施方式中，所述方波伏安法的测试参数为：
18、初始电位-0.1v，终止电位0.5v，电位增量5mv，频率50赫兹，脉冲电位25mv；或
19、初始电位-0.1v终止电位0.6v电位增量2mv频率50赫兹脉冲电位25mv；或
20、初始电位-0.1v终止电位0.6v电位增量5mv频率25赫兹脉冲电位25mv；或
21、初始电位-0.1v终止电位0.6v电位增量5mv频率50赫兹脉冲电位5mv。
22、在本发明一些实施方式中，所述方波伏安法得到的特征曲线中特征峰在0.2v到0.4v之间。
23、在本发明一些实施方式中，所述方波伏安法得到的特征曲线中特征峰在0.2v到0.3v之间。
24、本发明中最大限度地优化了电化学测试最重要的三个方面：扫描方向、扫描范围、扫描速度，显著提高了电化学测试的灵敏度。
25、本发明金电极作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，组成三电极体系，使用1mmol/l二茂铁溶液与0.1mol/l氯化钾溶液作为电解液，最大限度地优化了检测人体血浆游离dna样本内ctdna的电化学测定条件，显著提高了检测结果的准确性和稳定性。
26、本发明的有益效果是：
27、本发明将人体游离dna样本吸附在金工作电极上，利用电化学工作站采用方波伏安法对样本中ctdna进行测定，建立起利用方波伏安法检测游离dna中ctdna的方法。本发明中的检测方法操作便捷、检测迅速、灵敏度高，可用于游离dna中ctdna的快速检测。
1.一种检测循环肿瘤dna的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为ssc缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工作电极于样品缓冲液中孵育时长为10至20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电化学传感器电极还包括参比电极和对电极，所述参比电极为ag/agcl电极，所述对电极为铂电极。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金电极于样品缓冲液中孵育之前还包括对所述金电极抛光、清洗、干燥的预处理步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电解液含有二茂铁溶液和氯化钾溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电解液为1mmol/l二茂铁溶液与0.1mol/l氯化钾溶液混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方波伏安法的测试参数为：初始电位-0.1v，终止电位0.5-0.6v，电位增量2-5mv，频率25-50赫兹，脉冲电位5-25mv。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方波伏安法的测试参数为：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方波伏安法得到的特征曲线中特征峰在0.2v到0.4v之间。
