本技术涉及植物基因编辑，具体涉及双子叶植物先导编辑系统及应用。
背景技术：
1、随着crispr系统被广泛的研究与应用，基因编辑领域高速发展，并因此衍生出多种新型的基因编辑系统，包括碱基编辑系统(base editor，be)、先导编辑系统(primeeditor，pe)等。利用上述基因编辑系统可更灵活、更高效、更安全地实现各种类型的基因编辑，为解决生命科学领域中存在的问题提供更有力的帮助。但现有的基因编辑工具，在编辑事件和编辑效率的层面具有各自局限性。例如碱基编辑器能够在不产生双链断裂、不供给dna供体模板的情况下，实现精确的单碱基替换，但是只能完成4种类型的碱基替换。在此背景下，能够在无双链断裂、无供体模板条件下完成任意碱基转换、删除及插入的先导编辑无疑更具优势。先导编辑系统基于crispr-cas9系统对基因组dna的靶向和单链切割，通过逆转录酶(rt，reverse transcriptase)对pegrna(prime editing grna)中的模板进行逆转录，进而生成含有目的编辑的dna单链，随后通过真核细胞的dna修复过程将含有的目的编辑序列整合入基因组dna。不同于以往的基因编辑系统，先导编辑系统的编辑结果精确而高效，能够为许多以往无法解决的现实问题提供新的解决途径。但目前先导编辑系统的应用实例较少，无法证实其具备多类型细胞的普遍适用性。
2、更高效、更精确一直是crispr基因编辑系统优化的主要方向。pe技术最早由davidliu实验室于2019年下旬开发并在酵母和人类细胞系中测试验证。pe在植物中的应用、系统性的研究改造主要集中于单子叶植物水稻中，代表性的植物pe系统为已报道的ppe(plantprime editing)系统(lin et al.,2020)。
3、目前低效的pe编辑效率是pe应用的最大阻碍。相较于单子叶植物，双子叶植物的pe效率更低，更容易导致pe失败的情形，因此，开发一种适于双子叶植物的pe系统至关重要。
技术实现思路
1、有鉴于此，本技术提供了一种高效双子叶植物先导编辑系统及应用。该先导编辑系统采用pol ii类型的启动子表达pegrna，pe蛋白采用多个蛋白的互作模式，从而显著提高了pe效率，实现了双子叶植物的基因编辑。
2、为了实现上述发明目的，本技术提供以下技术方案：
3、第一方面，本技术提供了一种先导编辑系统，其包含：
4、i)pegrna和/或含有编码pegrna的核苷酸序列的表达构建体，
5、其中pegrna自5’端至3’端依次包含第一gly trna、间隔子序列(spacer)、grna支架序列(scaffold)、逆转录模板序列(rtt)、引物结合序列(pbs)、第二gly trna；和/或
6、ii)先导编辑融合蛋白和/或含有编码先导编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，其中先导编辑融合蛋白包含cas9核酸酶和逆转录酶；
7、其中pegrna由pol ii类型的启动子启动表达，且能够与先导编辑融合蛋白形成复合物，并将先导编辑融合蛋白靶向基因组中的靶序列，导致靶序列内的切口。
8、在本技术实施方式中，编码pegrna的核苷酸序列的表达构建体自5’端至3’端依次包含第一启动子、第一gly trna、间隔子序列(spacer)、grna支架序列(scaffold)、逆转录模板序列(rtt)、引物结合序列(pbs)、第二gly trna和第一终止子；所述第一启动子为polii类型的启动子。
9、作为优选，所述pol ii类型的启动子包括35s启动子、ubi启动子、actin启动子、ub10启动子等。
10、在本技术一实施方式中，先导编辑融合蛋白包含：
11、a)第一蛋白，所述第一蛋白包括cas9核酸酶；
12、b)第二蛋白，所述第二蛋白包括gcn4；
13、c)第三蛋白，所述第三蛋白包括由抗gcn4的单链抗体(scfv)、促溶蛋白和逆转录酶(rt)依次组成的融合蛋白。
14、在本技术另一实施方式中，先导编辑系统包含：
15、i)pegrna，其自5’端至3’端依次包含第一gly trna、间隔子序列(spacer)、grna支架序列(scaffold)、逆转录模板序列(rtt)、引物结合序列(pbs)、ms2适配体序列、第二glytrna；
16、ii)先导编辑融合蛋白，其包含：
17、a)第一蛋白，所述第一蛋白包括cas9核酸酶；
18、b)第二蛋白，所述第二蛋白包括由mcp和gcn4组成的融合蛋白；
19、c)第三蛋白，所述第三蛋白包括由抗gcn4的单链抗体(scfv)、促溶蛋白和逆转录酶(rt)依次组成的融合蛋白。
20、在本技术的具体实施方式中，gcn4和scfv可以为单拷贝，也可以为多拷贝。
21、作为优选，gcn4和scfv为单拷贝。
22、在本技术实施方式中，第一终止子包括但不限于hspt，但第一终止子的种类并非限定于此，本领域认可的其它终止子种类也均在本技术保护范围之内。
23、在本技术实施方式中，含有编码先导编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体还包括第二启动子、核定位序列nls、第二终止子。
24、优选的，第二启动子包括35s启动子、ubi启动子、actin启动子、ub10启动子中的至少一种；但第二启动子的种类并非限定于此，本领域认可的其它启动子种类也均在本技术保护范围之内。
25、优选的，第二终止子包括e9t。但第二终止子的种类并非限定于此，本领域认可的其它终止子种类也均在本技术保护范围之内。
26、一般而言，多肽中的一个或多个nls应具有足够的强度，以便在细胞的核中驱动多肽以可实现其基因编辑功能的量积聚。在本技术实施方式中，核定位序列nls的数量不低于3个。示例性的，核定位序列nls的数量为3、4、5、6、7、8、9、10个等。
27、在本技术实施方式中，nls由暴露于蛋白表面上的带正电的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成，但其他类型的nls也是已知的。nls的非限制性实例包括：kkrkv(核苷酸序列5’aagaagagaaaggtc 3’)、pkkkrkv(核苷酸序列5’cccaagaagaagaggaaggtg 3’或ccaaagaagaagaggaaggtt)，或sggspkkkrkv(核苷酸序列5’tcgggggggagcccaaagaagaagcggaaggtg 3’)。
28、在本技术实施方式中，核定位序列nls设置在第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的5’端和/或3’端，或者融合蛋白中两个蛋白之间。示例性的，第一蛋白cas9核酸酶5’端和3’端各设置有1个nls；第二蛋白的mcp和gcn4之间设置有2个nls，3’端设置有1个nls，第三蛋白5’端和3’端各设置有1个nls。
29、在本技术实施方式中，第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白可在一个表达构建体中表达，也可在不同的表达构建体中表达，优选在一个表达构建体中表达。在一个表达构建体中表达至少两种蛋白时，编码两种蛋白的核苷酸序列之间还包括自裂解肽序列，以实现单个载体上同时表达多个基因的目的。自裂解肽序列包括来源于脑心肌炎病毒emcv的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,ires)或来源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2a(self-cleaving 2a peptide,2a)，2a多肽包括来自猪捷申病毒(porcine techovirus 1)的p2a、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea asigna virus)的t2a、来自马甲型鼻病毒(equine rhinitis a virus)的e2a、来自口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)的f2a中的至少一种。本领域也已知多种这些2a多肽的功能性变体，这些变体也可以用于本技术。
30、在本技术实施方式中，第一蛋白cas9核酸酶为ncas9h840a。但cas9核酸酶的种类并非限定于此，本领域认可的其它cas9核酸酶种类也均在本技术保护范围之内。
31、在本技术实施方式中，第二蛋白可为mcp-gcn4融合蛋白，也可为gcn4-mcp融合蛋白。
32、在本技术实施方式中，第三蛋白中的逆转录酶(rt)为mlv-rt。但rt的种类并非限定于此，本领域认可的其它rt种类也均在本技术保护范围之内。
33、在本技术实施方式中，促溶蛋白包括gb1和/或sfgfp。
34、示例性的，所述pol ii策略的pegrna表达构建体构建如下：采用拟南芥ub10启动子atub10，在需要被转录pegrna序列的两端加入gly-trna序列以实现pegrna的精准切割，以hsp终止子(hspt)终止转录。先导编辑融合蛋白(mpe蛋白)的表达构建体包括：osubi1启动子、nls核定位序列、ncas9h840a序列、nls核定位序列、t2a肽序列、mcp序列(结合ms2适配体)、nls核定位序列、nls核定位序列、gcn4蛋白序列(结合scfv)、nls核定位序列、p2a肽序列、nls核定位序列、scfv蛋白序列(结合scfv)、促溶蛋白序列(gb1或sfgfp)、mlv-rt序列、nls核定位序列、e9终止子(e9t)。
35、第二方面，本技术提供了一种生物材料，该生物材料包含上述先导编辑系统。
36、在本技术实施方式中，所述生物材料为重组载体。
37、在本技术实施方式中，对于载体的具体种类不作限定，能够满足成功构建重组载体，且该载体能够通过工程菌介导进入植物中正常发挥基因编辑系统的功能即可。具体的，载体包括但不限于pkse401、pkse402、pgreb32、phr04、pcxun-be3。
38、在本技术实施方式中，所述生物材料为经遗传修饰的植物细胞。
39、在本技术实施方式中，所述经遗传修饰的植物细胞被导入上述先导编辑系统，由此导致所述细胞的基因组中靶序列的修饰。
40、进一步，所述导入方式包括农杆菌介导法、ti质粒转化法、ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法中的一种。优选农杆菌介导法。
41、在本技术实施方式中，所述农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌eha105、农杆菌lba440、农杆菌eha101、农杆菌gv3101。
42、在本技术实施方式中，所述植物细胞的基因组中存在大量的4t或连续更多个t碱基。
43、优选的，所述植物细胞为双子叶植物细胞。
44、在本技术实施方式中，所述生物材料为经遗传修饰的非植物细胞。
45、在本技术实施方式中，所述经遗传修饰的非植物细胞的基因组中存在大量的4t或连续更多个t碱基。
46、在本技术实施方式中，上述经遗传修饰的非植物细胞被导入上述先导编辑系统，由此导致所述细胞的基因组中靶序列的修饰。
47、第三方面，本技术提供了一种产生经遗传修饰的植物细胞或非植物细胞的方法，该方法将上述先导编辑系统导入至少一个所述植物细胞或非植物细胞，由此导致所述至少一个植物细胞或非植物细胞的基因组中靶序列的修饰。
48、在本技术实施方式中，所述植物细胞或非植物细胞的基因组中存在大量的4t或连续更多个t碱基。
49、在本技术实施方式中，本技术提供了一种产生经遗传修饰的双子叶植物细胞的方法，该方法将上述先导编辑系统导入至少一个双子叶植物细胞，由此导致所述至少一个双子叶植物细胞的基因组中靶序列的修饰。
50、第四方面，本技术提供了一种产生双子叶基因编辑植物的方法，该方法包括：将上述先导编辑系统转入双子叶植物，然后对包含先导编辑系统的双子叶植物进行培养，得到基因编辑植物。
51、在本技术实施方式中，所述转入方式包括农杆菌介导法、ti质粒转化法、ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法中的一种。优选农杆菌介导法。
52、在本技术实施方式中，所述农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌eha105、农杆菌lba440、农杆菌eha101、农杆菌gv3101。
53、作为优选，在产生双子叶基因编辑植物的方法中，培养的方式为：将双子叶植物先进行变温培养，然后进行常温培养。
54、在本技术实施方式中，变温培养包括至少1个循环周期，1个循环周期为：在36～38℃下培养1.5～2.5h，然后在20～27℃下培养5～7h。
55、优选的，变温培养包括9～30个循环周期，1个循环周期为：在37℃下培养2h，然后在22～25℃下培养6h。
56、在本技术中，变温培养也称为循环高温处理(repeated high temperaturetreatment，rhtt)，rhtt可在mpe已提高pe效率的基础上进一步提高精确编辑效率，而对植物造成较小的热胁迫，有助于应用于植物育种。在本技术具体实施方式中，rhtt单循环为：37℃2h热处理，25℃(或22℃)6h恢复。不断重复这一循环使得编辑效率积累。
57、在本技术实施方式中，在对本氏烟进行叶片注射的瞬时表达实验时，rhtt应用于注射后36h，循环为：37℃2h，25℃6h。
58、在本技术实施方式中，rhtt应用于拟南芥时，分为两个阶段。第一阶段为每代拟南芥播种后第八天长出幼苗时进行，循环为：37℃2h，22℃6h，重复该循环120h(5天)。幼苗经rhtt处理后移至正常温度下(22℃)，待盛花期进行第二阶段的rhtt，循环为：37℃2h，22℃6h，重复该循环240h(10天)。最后将植株移至正常温度下直至收种子。
59、在本技术实施方式中，常温培养的温度为20～27℃，优选22～25℃。
60、在本技术实施方式中，将上述先导编辑系统转入双子叶植物的方法包括农杆菌介导法、ti质粒转化法、ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法中的一种。
61、在本技术实施方式中，农杆菌介导法包括浸花法、叶盘法和注射法中的至少一种。
62、在本技术实施方式中，双子叶植物包括但不限于本氏烟草、拟南芥、普通烟草、番茄、马铃薯、大豆、花生、向日葵、棉花、苹果、柑橘中的至少一种。
63、第五方面，本技术提供了一种双子叶基因编辑植物，该植物中至少一个细胞被导入所述先导编辑系统，由此导致所述植物至少一个细胞的基因组中靶序列的修饰。
64、与现有技术相比，本技术具有的有益效果为：
65、本技术首先改进了pe编辑系统，创制了pe2和mpe等。本技术改进的pe系统具有广泛提高pe效率的能力，且尤其适用于对双子叶植物的pe编辑，提高幅度从1.3倍至1288.5倍不等，特别地，mpe能提高若干个碱基精确插入的效率，针对拟南芥和本氏烟5个靶点上的11种插入事件，mpe将pe效率平均提高197.88倍。
66、本技术还开发了进一步提升pe编辑效率的方法，包括在实施pe编辑植株时进一步提高pe效率的循环高温处理(rhtt)步骤，其中mpe通过叠加rhtt后，将nbpds靶点上ggatcca精确插入效率提高至约1％，此效率预示着mpe将pe应用于双子叶植物育种从难以实现过渡到可操作，通过多轮rhtt本技术最终获得了pe稳定编辑植株。
67、本技术除了能为科学研究提供创制突变体的工具外，还将为植物合成生物学底盘设计和双子叶植物育种提供技术支持。
1.一种先导编辑系统，其包含：
2.根据权利要求1所述的先导编辑系统，其特征在于，编码所述pegrna的核苷酸序列的表达构建体自5’端至3’端依次包含第一启动子、第一gly trna、间隔子序列(spacer)、grna支架序列(scaffold)、逆转录模板序列(rtt)、引物结合序列(pbs)、第二gly trna和第一终止子；所述第一启动子为pol ii类型的启动子。
3.根据权利要求1所述的先导编辑系统，其特征在于，所述先导编辑融合蛋白包含：
4.根据权利要求3所述的先导编辑系统，其特征在于，所述先导编辑系统包含：
5.根据权利要求3或4所述的先导编辑系统，其特征在于，所述促溶蛋白包括gb1和/或sfgfp。
6.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1-5中任一项所述的先导编辑系统。
7.一种产生经遗传修饰的双子叶植物细胞的方法，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述先导编辑系统导入至少一个所述双子叶植物细胞，由此导致所述至少一个双子叶植物细胞的基因组中靶序列的修饰。
8.一种产生双子叶基因编辑植物的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-5中任一项所述先导编辑系统转入双子叶植物，然后对包含先导编辑系统的双子叶植物进行培养，得到基因编辑植物。
9.根据权利要求8所述的产生双子叶基因编辑植物的方法，其特征在于，所述培养的方式为：将所述双子叶植物先进行变温培养，然后进行常温培养；
10.根据权利要求8-9中任一项所述的产生双子叶基因编辑植物的方法，其特征在于，所述双子叶植物包括本氏烟草、拟南芥、普通烟草、番茄、马铃薯、大豆、花生、向日葵、棉花、苹果、柑橘中的至少一种。
