本发明属于生物，具体涉及一种提高哺乳动物细胞狂犬病毒vlp蛋白表达量的生产方法。
背景技术：
1、狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus，rv)感染引起的一种病症严重、病死率极高的自然疫源性的人兽共患病，死亡率几乎100％，目前尚无特殊有效的治疗措施，目前对狂犬病尚有效的治疗方法，接种狂犬病毒疫苗(以下简称狂犬疫苗)和使用抗狂犬病血清至今仍是预防感染狂犬病的主要方法。野生动物是rv的主要储存宿主，人和家养动物的感染发病主要是接触携带狂犬病毒的野生动物。在中国，狂犬病传播的主要来源是犬。因此，犬是狂犬病控制的重要环节，而给犬类接种狂犬疫苗是控制狂犬病的最有效措施。当前犬狂犬病疫苗覆盖率低，并且主要使用的是灭活疫苗。然而，灭活疫苗在生产过程中仍存在许多技术难点和安全隐患，包括制备工艺复杂，细胞大规模悬浮培养、病毒的扩大生产、病毒的滴度低以及有效抗原量低等。因此，需要一种更加安全有效的，方便配制的，成本低廉的，能够快速诱导高效免疫应答的疫苗制剂。而vlp(virus-like particle，病毒样颗粒)疫苗能很好地符合这些需要，因其安全性高、免疫效力高、广泛适应性、表达系统多样性且可作为鉴别诊断等优点，被认为是最有可能替代传统灭活疫苗的最佳候选疫苗形式。
2、g蛋白是狂犬病毒的主要免疫保护性抗原，且比较保守，可以诱导特异性中和抗体的产生，也可刺激机体产生细胞免疫，在抵抗狂犬病毒的攻击中起到重要的作用。哺乳动物表达系统是生产vlp的最有吸引力的平台。作为天然宿主，哺乳动物细胞提供的翻译后修饰机制能够保证vlp的正确折叠。且能高效分泌表达、易于纯化等优点，广泛应用于基因治疗产品及疫苗、抗体等研发。
技术实现思路
1、针针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种提高哺乳动物细胞狂犬病毒vlp蛋白表达量的生产方法。本发明提供的生产方法，产能高且培养条件稳定，可多批次收获，且具有很高的重复性和稳定性，应用前景广阔。
2、本发明的提高哺乳动物细胞狂犬病毒vlp蛋白表达量的方法，包括如下步骤：
3、s1种子细胞接种及培养：将表达狂犬病毒vlp蛋白的哺乳动物细胞种子细胞在摇瓶中利用无血清培养液培养后，接种至生物反应器中，继续用无血清培养液培养；
4、s2蛋白的收获及换液：待细胞生长参数和培养液参数达到要求时，收集培养液上清，同时更换部分培养液，直至细胞生长参数达不到要求参数时，收集所有培养液离心后取上清。
5、通过利用生物反应器控制良好的培养环境，并结合培养收获工艺改进——部分换液，分批收获，可大大提高细胞培养效率，获得高蛋白表达量。
6、对于哺乳动物来源的蛋白表达，293细胞和cho细胞无疑是最佳选择，优选地，所述种子细胞为表达狂犬病毒vlp蛋白的hek-293t-rabv vlp细胞。
7、优选地，所述生物反应器为激流式生物反应器，采用激流式传氧机制进行传氧，培养效果更好。
8、优选地，所述无血清培养液为添加了8mmol/l l-谷氨酰胺的hek293细胞全悬浮无血清培养液，其中还含有4mm谷氨酰胺、6g/l葡萄糖、1.5g/lpf68。
9、优选地，将种子细胞在摇瓶中利用无血清培养液培养至1e+7个/ml后接种于至生物反应器中。
10、优选地，细胞在生物反应器中的接种密度为1e+6个/ml。
11、优选地，所述步骤s1中，生物反应器中培养条件为：培养温度：37-37.5℃，细胞培养ph：7.0-7.5，细胞培养do：40％-80％，转速：50-100rpm；并每天添加葡萄糖至培养液中浓度达到4g/l，从第2天开始隔天流加补料。
12、分批收获的细胞参数和培养液参数要求可以根据具体培养细胞的情况来确定，如细胞的活性，大小，及培养液的成分情况等。
13、优选地，细胞生长参数要求：细胞密度≥1e+7个/ml、活率≥80％、且直径为16-18μm。
14、优选地，培养液参数要求：满足以下①-③中至少一项，可以是1项、2项或3项；①葡萄糖消耗每天大于2g/l、②乳酸浓度为高于20mmol/l、③l-谷氨酰胺的含量为小于2mmol/l。
15、优选地，所述步骤s2中，每次收集1/2-3/4体积(整个培养液体积占比)的培养液上清，并换入等量新的无血清培养液。
16、每次收集间隔天数根据培养情况决定，优选地，每隔3-5天。
17、与现有技术相比，本发明提供的生产方法具有如下优势：
18、(1)本发明方法利用生物反应器全悬浮无血清培养结合分批收获，使得培养的细胞密度高，蛋白表达量高，节约了很多人力物力成本，使得该疫苗性价比高，具有很大的应用前景。
19、(2)本发明方法由于采用生物反应器，整个过程中加液、收液都由系统控制，减少操作步骤，降低污染概率，进一步提高生产工艺的稳定性。
20、(3)本发明进一步通过优化生产过程中的各个参数，一次实验最多可以收集4批次表达蛋白，且每批次的蛋白产量都稳定，每批蛋白表达量都能达到摇瓶产量10倍以上，产能高且培养条件稳定，具有很高的重复性和稳定性。
1.一种提高哺乳动物细胞狂犬病毒vlp蛋白表达量的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述种子细胞为hek-293t-rabv vlp细胞。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述生物反应器为激流式生物反应器。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述无血清培养液为添加了8mmol/ll-谷氨酰胺的hek293细胞全悬浮无血清培养液，其中还含有4mm谷氨酰胺、6g/l葡萄糖、1.5g/l pf68。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，将种子细胞在摇瓶中利用无血清培养液培养至1e+7个/ml后接种于至生物反应器中。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，细胞在生物反应器中的接种密度为1e+6个/ml。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，生物反应器中培养条件为：培养温度：37-37.5℃，细胞培养ph：7.0-7.5，细胞培养do：40％-80％，转速：50-100rpm；并每天添加葡萄糖至培养液中浓度达到4g/l，从第2天开始隔天流加补料。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤s2中，细胞生长参数要求为：细胞密度≥1e+7个/ml、活率≥80％、且直径为16-18μm。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤s2中，培养液参数要求为：满足以下①-③中至少一项，①葡萄糖消耗每天大于2g/l、②乳酸浓度高于20mmol/l、③l-谷氨酰胺的含量小于2mmol/l。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤s2中，每次收集占整个培养液体积1/2-3/4的培养液上清，并换入等量新的培养液。
