本发明属于生物工程领域,具体涉及一种复合型纳米硅球递药体系及其制备方法和应用,依靠其表面包覆的血小板膜精准靶向肿瘤细胞。
背景技术:
1、结直肠癌(crc)已成为全球范围内发病率逐年上升的常见消化道肿瘤,其死亡率仅次于肺癌,高居全球癌症致死原因的第二位。当前,免疫治疗在结直肠癌治疗中占据了举足轻重的地位。然而,对于占比高达85%~90%的微卫星稳定型(mss)结直肠癌患者而言,单一的免疫检查点抑制剂治疗策略往往收效甚微。近期研究显示,肿瘤细胞外基质(ecm)中的胶原基质硬度可能构成了一道物理屏障,阻碍了免疫治疗药物的有效作用。
2、介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)作为一种新兴的纳米材料,以其独特的物理特性和作为药物载体的巨大潜力而备受瞩目。因此,设计并构建一种能够精准靶向肿瘤细胞、有效降低肿瘤基质硬度,并能解除免疫检查点封锁的纳米硅球药物递送系统,对于提升结直肠癌免疫治疗的疗效具有深远的意义。
3、传统的给药方式,如静脉注射或口服,常受限于药物在体内的药代动力学性质、分布不均、肿瘤部位药物浓度难以预测,以及可能引发的全身副作用等问题,从而影响抗肿瘤效果。纳米药物递送系统的出现,以其独特的优势如改善药物动力学特性、实现肿瘤靶向递送、以及肿瘤微环境响应性定点释药等,为免疫检查点类药物的靶向递送提供了新的可能,有望显著提高药物的生物利用度,进而获得更为理想的抗肿瘤效果,展现出极大的临床应用前景。
4、随着材料科学和药剂学的深入研究,纳米技术得到了前所未有的发展。其中,介孔二氧化硅纳米颗粒(msns)以其孔径可调、非晶框架灵活多变、比表面积大等显著特点而广受关注。尽管msns本身并不具备生物或化学活性,但其孔内表面的硅醇基团为进一步的化学修饰提供了丰富的可能性,如通过烷基化修饰可结合多种有机基团(如氨基、苯基、巯基和乙烯基等),从而引入催化活性中心。此外,通过化学修饰还可有效改善msns的分散性能。其独特的空隙空间和纳米笼结构使得小分子药物的高效载入和化学结合成为可能,进而显著提高载药量并防止药物过早泄露。这些单分散二氧化硅纳米颗粒在生物医药领域的优异表现,预示着它们在未来肿瘤个体化治疗中可能扮演的重要角色。
5、然而,纳米颗粒在进入人体后常面临被血浆蛋白包裹的问题,进而经由肝脏或肾脏等代谢器官被过早排出,这大大降低了纳米药物的生物利用度。近年来,以细胞膜为涂层的递送载体作为一种简单有效的仿生给药方式备受关注。这种递送方式具有延长循环时间、减轻免疫原性、实现主动靶向等显著优势。其中,血小板作为一种特殊的血细胞,具有靶向血管损伤部位并与肿瘤细胞识别黏附的能力。血小板膜富含的p-选择素能与肿瘤细胞表面的cd44分子实现特异性结合,从而使得血小板膜包被的纳米颗粒具备基于受体膜识别分子的同源靶向能力和出色的生物相容性。
6、地法替尼(defactinib)作为一种fak小分子抑制剂,通过抑制局灶粘附蛋白酪氨酸397(y397)位点的反式自磷酸化来发挥作用。当肿瘤基质诱导的物理信号通过整合素(integrin)传递给肿瘤细胞时,fak在integrin聚集位点的抑制作用会阻断其作为分子支架招募src家族磷酸化激酶结构域的功能,进而抑制下游信号通路的转导。这最终降低了肿瘤细胞对外界物理压力的反馈。因此,通过抑制fak活性可以有效调节肿瘤基质刚度,促进纳米颗粒更深入地渗透到肿瘤组织中并增强erp效应。此外,松解的肿瘤基质还有助于提高细胞毒性t细胞的浸润程度,从而实现肿瘤免疫微环境的“升温”效果。
技术实现思路
1、解决的技术问题:本发明提供一种复合型纳米硅球递药体系及其制备方法和应用,在表面介孔中以静电吸附的方式负载地法替尼——fak小分子抑制剂,并在pm表面偶联pd-l1抗体,通过静脉注射的方式共同递送两种药物,以期使仿生纳米颗粒精准靶向肿瘤细胞与术后微小残留灶,降低肿瘤基质硬度促进纳米颗粒与杀伤性t细胞渗透进入肿瘤组织,解除肿瘤细胞的免疫检查点封锁作用,促进t细胞高效杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤生长复发的同时克服dmmr/msi-h肿瘤的原发或继发性耐药,改善结直肠癌患者的远期生存与预后。
2、技术方案:一种复合型纳米硅球递药体系,该体系以介孔二氧化硅纳米颗粒为载体,负载地法替尼的同时,表面包覆pd-l1抗体修饰的血小板膜;使用透射电子显微镜和激光动态光散射粒度分析仪对该纳米颗粒进行形貌分析:该纳米颗粒呈均匀分散、大小一致的实心球形,平均水合粒径约为150nm,表面可见清晰规则的介孔结构特点;比表面积和孔容积分别为~765.7m2/g 和 1.12cm3/g,孔径约为5-7 nm;ftir图谱中803cm-1、960cm-1、1093cm-1处的吸收峰表明存在 si-o-si,在3440cm-1处的收缩振动峰表明存在si-oh;zeta电位分析结果表明该纳米颗粒的平均电位为-32.8mv。
3、上述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,步骤包括:(1)载药介孔二氧化硅纳米颗粒(msn@d)的制备:首先将介孔二氧化硅纳米颗粒加入无水乙醇中,室温下超声,使介孔二氧化硅纳米颗粒完全分散在无水乙醇中得介孔二氧化硅纳米颗粒混悬液;将地法替尼(defactinib)药物加入介孔二氧化硅纳米颗粒混悬液中,再次超声使之与介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散;室温下将该混合物搅拌,以离心除去未负载的药物,沉淀物即为msn@d纳米颗粒;(2)包覆血小板膜载药介孔二氧化硅纳米颗粒(msn@d@pm)的制备:将msn@d纳米颗粒分散在含有血小板膜的pbs溶液中,冰上超声处理,得msn@d@pm;(3)msn@d@pm@ab纳米颗粒的制备:用traut试剂将msn@d@pm膜表面硫代化45 min,然后用tyrode缓冲液洗涤去除多余的traut试剂;将pd-l1抗体与磺基琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(sulfo-smcc)连接剂在4℃下混合,多余的连接剂通过透析弃去,得到apd-l1-sulfo-smcc;将msn@d@pm与apd-l1-sulfo-smcc以蛋白质量比1:10混合,室温反应后,离心去除上清液中未结合的pd-l1抗体,沉淀物冻干后得到msn@d@pm@ab。
4、优选的,上述msn@d: 血小板膜的质量比为5:1。
5、优选的,上述pd-l1抗体与磺基琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(sulfo-smcc)的摩尔比为1:5。
6、优选的,上述透析所用膜的分子量截止尺寸为10 kda。
7、优选的,上述体系中地法替尼药物的最佳载药率为33.5%,载药量为25.1%。
8、上述方法制得的复合型纳米硅球递药体系。
9、上述复合型纳米硅球递药体系在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。
10、一种治疗结直肠肿瘤药物,有效成分含有上述复合型纳米硅球递药体系。
11、有益效果:本发明制得了一种复合型多功能介孔二氧化硅纳米颗粒,负载地法替尼的同时表面包覆pd-l1抗体修饰的血小板膜,使其能够定向到达肿瘤手术血管破损部位并杀伤残余肿瘤细胞的同时降低该处微环境中基质硬度,增强免疫细胞渗透与毒性功能,这两种作用相互依赖,相互增强,克服结直肠肿瘤免疫治疗无效并延长患者生存期。实验表明,该纳米颗粒能够显著抑制小鼠体内盲肠原位肿瘤生长,降低肿瘤组织胶原交联的同时,增强肿瘤中心与边沿处cd8+t细胞数量。此外,治疗期内小鼠体重无显著下降,脾脏体积回缩至正常,该纳米颗粒对小鼠体内主要脏器均无明显毒副作用,说明其有较大临床转化应用价值。
1.一种复合型纳米硅球递药体系,其特征在于,该体系以介孔二氧化硅纳米颗粒为载体,负载地法替尼的同时,表面包覆pd-l1抗体修饰的血小板膜;使用透射电子显微镜和激光动态光散射粒度分析仪对该纳米颗粒进行形貌分析:该纳米颗粒呈均匀分散、大小一致的实心球形,平均水合粒径约为150nm,表面可见清晰规则的介孔结构特点;比表面积和孔容积分别为~765.7m2/g 和 1.12cm3/g,孔径约为5-7 nm;ftir图谱中803cm-1、960cm-1、1093cm-1处的吸收峰表明存在 si-o-si,在3440cm-1处的收缩振动峰表明存在si-oh;zeta电位分析结果表明该纳米颗粒的平均电位为-32.8mv。
2.权利要求1所述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,其特征在于,步骤包括:(1)载药介孔二氧化硅纳米颗粒(msn@d)的制备:首先将介孔二氧化硅纳米颗粒加入无水乙醇中,室温下超声,使介孔二氧化硅纳米颗粒完全分散在无水乙醇中得介孔二氧化硅纳米颗粒混悬液;将地法替尼(defactinib)药物加入介孔二氧化硅纳米颗粒混悬液中,再次超声使之与介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散;室温下将该混合物搅拌,以离心除去未负载的药物,沉淀物即为msn@d纳米颗粒;(2)包覆血小板膜载药介孔二氧化硅纳米颗粒(msn@d@pm)的制备:将msn@d纳米颗粒分散在含有血小板膜的pbs溶液中,冰上超声处理,得msn@d@pm;(3)msn@d@pm@ab纳米颗粒的制备:用traut试剂将msn@d@pm膜表面硫代化45 min,然后用tyrode缓冲液洗涤去除多余的traut试剂;将pd-l1抗体与磺基琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(sulfo-smcc)连接剂在4℃下混合,多余的连接剂通过透析弃去,得到apd-l1-sulfo-smcc;将msn@d@pm与apd-l1-sulfo-smcc以蛋白质量比1:10混合,室温反应后,离心去除上清液中未结合的pd-l1抗体,沉淀物冻干后得到msn@d@pm@ab。
3.根据权利要求2所述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,其特征在于,所述msn@d:血小板膜的质量比为5:1。
4.根据权利要求2所述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,其特征在于,所述pd-l1抗体与磺基琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(sulfo-smcc)的摩尔比为1:5。
5.根据权利要求2所述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,其特征在于,所述透析所用膜的分子量截止尺寸为10 kda。
6.根据权利要求2所述复合型纳米硅球递药体系的制备方法,其特征在于,所述体系中地法替尼药物的最佳载药率为33.5%,载药量为25.1%。
7.权利要求2-6任一所述方法制得的复合型纳米硅球递药体系。
8.权利要求1所述复合型纳米硅球递药体系在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。
9.一种治疗结直肠肿瘤药物,其特征在于,有效成分含有权利要求1所述复合型纳米硅球递药体系。