本发明属于干细胞制剂领域，具体涉及一种用于缓解眼外肌退化的肌肉干细胞外泌体的制备方法及所得产品、应用。
背景技术：
1、眼球运动对于动物更好地感知外周世界具有极其重要的作用。控制眼球运动功能的眼外肌在衰老个体或某些疾病中常发生萎缩和功能退化，这与眼位异常、麻痹性斜视、近视、老花等眼睛功能的损伤退化有关，也可能导致两眼眼外肌的平衡协调同向运动功能的损伤。肌肉干细胞及其外泌体可有效修复肌肉组织的损伤，且基本没有副作用。肌肉干细胞外泌体包含多种可促进肌肉再生的活性成分。notch信号通道的激活是肌肉干细胞保持长期自我更新能力所必须的，而在衰老肌肉组织中的表达显著降低。肌肉组织中衰老细胞的存在可产生僵尸效而损伤正常肌肉干细胞的功能和肌肉的再生。
2、近年来医药行业中各种功效显著的细胞相关药物的快速发展广受关注。而肌肉干细胞相关的医疗研究和应用尚处于初步阶段。由于衰老、组织损伤或疾病导致的眼外肌的萎缩退化尚缺乏安全高效的治疗手段，在临床治疗和日常眼睛健康维护方面都会对这类技术有着较大的需求。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于延缓眼外肌衰老萎缩的肌肉干细胞外泌体的制备方法，通过将肌肉干细胞外泌体结合了notch激活剂和可靶向杀死衰老细胞的senolytics药物漆黄素（fisetin）进行装载，再结合具有护眼效果的叶黄素（lutein）的装载，可有效改善眼外肌的萎缩和衰老，维护眼睛的健康。
2、本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的肌肉干细胞外泌体。
3、本发明的另一目的为提供了上述肌肉干细胞外泌体在制备用于延缓眼外肌衰老萎缩的药物中的应用。
4、本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
5、本发明提供了一种用于延缓眼外肌衰老萎缩的肌肉干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
6、（1）分离和培养高活性的肌肉干细胞：将提取的肌肉干细胞（hmpc），运用流式细胞仪对具有较高aldh1和notch3表达的细胞（aldh1+/notch3+ hmpc）进行筛选分离，然后使用加入含jagged1多肽和漆黄素的培养基进行培养扩增；
7、（2）高效获得装载有jagged1多肽、漆黄素和叶黄素的肌肉干细胞外泌体： 将aldh/notch3高表达的肌肉干细胞进行培养, 加入含有jagged1多肽、漆黄素和叶黄素的无血清培养液，连续培养后取培养液上清低温超高速离心获得装载有jagged1多肽、漆黄素和叶黄素的外泌体。
8、进一步的，步骤（1）中，筛选分离出20~40%的表达aldh1和 notch3最高的细胞。
9、进一步的，步骤（1）中，所述培养基中jagged1多肽的浓度为10~30mg/l，漆黄素的浓度为5~25mg/l；所述培养基的组成为：含有5-15% fbs的低糖dmem培养基。
10、进一步的，步骤（1）中，所述培养扩增的条件为5%co2， 37oc的细胞培养箱中进行。
11、进一步的，步骤（2）中，所述肌肉干细胞为处于对数生长期的第4到6代的aldh1/notch3高表达的细胞。
12、进一步的，步骤（2）中，所述无血清培养液中，jagged1多肽的浓度为10~30mg/l、漆黄素的浓度为5~20mg/l、叶黄素的浓度为5~15mg/l。
13、进一步的，步骤（2）中，所述连续培养的天数为2~4天，5%co2， 37oc的细胞培养箱中。
14、本发明还提供了一种利用上述制备方法制备得到的肌肉干细胞外泌体。
15、本发明还提供了上述肌肉干细胞外泌体在制备延缓眼外肌衰老萎缩的药物中的应用。
16、本发明所使用的肌肉干细胞（hmpc）提取自人体。
17、本发明提供的制备方法中，当细胞培养48-72h 后，外泌体在细胞培养液中的最终浓度可达到10~20μg/ml；外泌体中装载的jagged1多肽为0.02~0.05 mg/mg外泌体，漆黄素为0.01~0.04 mg/mg外泌体, 叶黄素的浓度为0.01-0.03mg/ mg外泌体
18、本发明制备得到的外泌体，可有助于产生用于临床治疗的外泌体类药品，或者用于日常护眼使用的滴眼液类产品。
19、对眼外肌进行处理的方法：将外泌体以一定比例悬浮溶解于生理盐水中，以滴眼液的方式滴入眼眶。
20、本发明的利用了高活性肌肉干细胞外泌体本身对肌肉组织的安全和良性的作用效果，并结合notch激活剂、senolytics药物和叶黄素来提升肌肉干细胞外泌体对受损伤眼外肌肌肉组织的积极功效。
21、本发明的有益效果为：
22、（1）本发明提供一种用于延缓眼外肌衰老萎缩和功能退化的肌肉干细胞外泌体的制备方法，所获的外泌体可以帮助改善眼外肌肌肉的健康。运用时，定量悬浮溶解于生理盐水，滴注入眼眶内，可与眼外肌细胞相互作用，被细胞所吸收，从而发挥外泌体携带的成分的作用；
23、（2）本发明首次将肌肉干细胞外泌体结合了notch激活剂和可靶向杀死衰老细胞的senolytics药物漆黄素（fisetin）进行装载，再结合具有护眼效果的叶黄素（lutein）的装载，可清除衰老的肌肉细胞，同时促进肌肉干细胞的再生。
24、（3） 本发明的肌肉干细胞外泌体具有干细胞特有的生物学活性因子和抗衰老药物，可利用来制备促进肌肉的健康生长和损伤后修复的合成药物或细胞修复药物等生物医药产品。
25、（4）本发明通过高活性干细胞分离培养技术，结合外泌体大规模制备和分离技术，简易低成本的外泌体载药技术，衰老细胞靶向清除技术等，有效帮助改善眼外肌衰老和萎缩问题，可广泛通用于各种肌肉组织的损伤修复问题， 例如帮助改善提眼肌功能损伤导致的眼睑下垂，面部肌肉萎缩导致的表情缺失或法令纹加深，以及各种肌肉组织的损伤的修复等，为更有效安全的维护眼睛健康提供新的技术选择。。
26、（5）本发明为改善眼外肌功能退化症状提供了一个新的选择，在安全性、生物相容性和有效性等方面具有较突出的优势。未来可结合3d立体细胞培养等技术进一步提高肌肉干细胞的活性和外泌体的产量，也可结合细胞膜破碎制备外泌体等技术进一步降低成本，更好的服务医疗级别的应用。
1.一种用于延缓眼外肌衰老萎缩的肌肉干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，筛选分离出20~40%的表达aldh1和 notch3最高的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述培养基中jagged1多肽的浓度为10~30mg/l，漆黄素的浓度为5~25mg/l；所述培养基的组成为：含有5-15% fbs的低糖dmem培养基。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述培养扩增的条件为5%co2， 37oc的细胞培养箱中进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述肌肉干细胞为处于对数生长期的第4到6代的aldh1/notch3高表达的细胞。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述无血清培养液中，jagged1多肽的浓度为10~30mg/l、漆黄素的浓度为5~20mg/l、叶黄素的浓度为5~15mg/l。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述连续培养的天数为2~4天，5%co2， 37oc的细胞培养箱中。
8.一种利用权利要求1-7所述的制备方法制备得到的肌肉干细胞外泌体。
9.一种如权利要求8所述的肌肉干细胞外泌体在制备延缓眼外肌衰老萎缩的药物中的应用。
