本发明属于细胞模型的构建，具体涉及一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型及其应用。
背景技术：
1、皮肤作为人体最大的器官，其直接与外环境接触，是人体抵御外界伤害的第一道防线。而敏感性皮肤特指皮肤在生理或病埋条件下出现的一种高反应状态，可表现有灼热、刺痛、瘙痒及紧绷感等主观症状，伴或不伴红斑、毛细血管扩张及脱屑等客观体征，主要发生于面部。原发敏感性皮肤是由遗传、精神因素等所致，某些物理因素(如季节、天气、温度、污染等)可诱发或加重。而继发敏感性皮肤使由于滥用护肤品破坏皮肤屏障、患有面部皮炎、光电治疗后不重视皮肤护理等。
2、研究发现敏感肌的形成与痛痒感受器trpv1有着明确的相关性，在受到外界刺激时，皮肤就会产生疼痛、灼热及瘙痒感。trpv1属于瞬时受体电位transient receptorpotential，trp蛋白家族，是一种非选择性阳离子通道膜蛋白，对钙离子具有高通透性。该通道蛋白主要分布于哺乳动物角质形成细胞及外周c类神经纤维，除了对热和多种化学刺激敏感外，还可以调节角质形成细胞的增殖、分化与凋亡，参与多项皮肤生理活动，并与多种皮肤疾病密切关联。
技术实现思路
1、本发明的第一目的在于提供一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其是一种稳定过表达人角质形成细胞(hacat)中trpv1离子通道蛋白形成的敏感皮肤细胞模型。使用慢病毒稳定转染hacat细胞获得过表达trpv1细胞株hacat-trpv1-flag，造成细胞内的ca2+离子流增加，建立敏感皮肤细胞模型，用于评价化合物、天然产物及药品的对皮肤敏感的影响，并验证其对trpv1通路的机制探究。
2、本发明的第二目的在于提供一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型，该模型可用于化合物、天然产物及药品对敏感细胞的ca2+离子内流情况检测以评价其对敏感皮肤的影响；还可用于检测天然产物提取物对细胞中trpv1离子通道表达的影响。
3、本发明通过以下技术方案实现：
4、一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，包括如下步骤：
5、s1、利用plv表达载体构建trpv1-flag慢病毒稳转质粒，其中，所述trpv1的核苷酸序列如seq id no.1所示；
6、s2、plv-trpv1-flag慢病毒包装质粒获得：
7、将所述s1中获得的慢病毒稳转质粒plv-trpv1-flag利用大肠杆菌转化、无内毒素质粒提取后，获得慢病毒包装质粒plv-trpv1-flag；
8、s3、hacat-trpv1-flag稳转细胞株病毒模型的获得：
9、(1)使用离体的人胚肾细胞制造慢病毒，待细胞密度达到80％，留作备用；
10、(2)磷酸钙转染混合体系的配置：
11、将plv-trpv1-flag质粒、慢病毒包装质粒和2.5m氯化钙混合，加去离子水至500μl，逐滴加入2×缓冲液混合制备成转染混合液；
12、(3)hacat-trpv1-flag稳转细胞株病毒模型的获得：
13、将所述转染混合液加入到含有慢病毒细胞的培养皿中，并与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中培养，待转染混合液加入到慢病毒细胞中开始计时，48h后收集培养上清液，上清液经离心、膜过滤、分装后，得到hacat-trpv1-flag稳转细胞株病毒模型。
14、作为优选地，所述s3中，慢病毒细胞在转染前2h更换新鲜预热的培养基；待更换完成后过2h，再配置磷酸钙转染混合体系；
15、所述新鲜预热的培养基为dmem培养基。
16、作为优选地，所述plv-trpv1-flag质粒、慢病毒包装质粒、氯化钙、缓冲液的配置比为13.3μg：30μl：50μl：500μl。
17、作为优选地，加入到含有慢病毒细胞的培养皿中的所述转染混合液的量为1ml。
18、作为优选地，所述与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中放置16～18h后，更换10～15ml新鲜预热的培养基进行细胞继续培养；
19、所述新鲜预热的培养基为dmem培养基。
20、作为优选地，所述上清液经在2000～2500rpm下离心5～6min；采用0.45μm滤膜。
21、一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型，由所述的构建方法得到。
22、一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型在检测化合物、天然产物和药物对敏感肌肤ca2+离子内流情况中的应用。
23、一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型在检测天然产物提取物对细胞中trpv1离子通道表达中的应用。
24、一种用于检测筛选肌肤敏感性药物的方法，所述方法是使用所述的用于测试肌肤敏感性的细胞模型来进行的。
25、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
26、本发明提供了一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其是一种稳定过表达人角质形成细胞(hacat)中trpv1离子通道蛋白形成的敏感皮肤细胞模型。使用慢病毒稳定转染hacat细胞获得过表达trpv1细胞株hacat-trpv1-flag，造成细胞内的ca2+离子流增加，建立敏感皮肤细胞模型，用于评价化合物、天然产物及药品的对皮肤敏感的影响，并验证其对trpv1通路的机制探究。
27、该用于测试肌肤敏感性的细胞模型，可用于化合物、天然产物及药品对敏感细胞的ca2+离子内流情况检测以评价其对敏感皮肤的影响；还可用于检测天然产物提取物对细胞中trpv1离子通道表达的影响。
1.一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述s3中，慢病毒细胞在转染前2h更换新鲜预热的培养基；待更换完成后过2h，再配置磷酸钙转染混合体系；
3.根据权利要求1所述的一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述plv-trpv1-flag质粒、慢病毒包装质粒、氯化钙、缓冲液的配置比为13.3μg：30μl：50μl：500μl。
4.根据权利要求1所述的一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，加入到含有慢病毒细胞的培养皿中的所述转染混合液的量为1ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中放置16～18h后，更换10～15ml新鲜预热的培养基进行细胞继续培养；
6.根据权利要求1所述的一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述上清液经在2000～2500rpm下离心5～6min；采用0.45μm滤膜。
7.一种用于测试肌肤敏感性的细胞模型，其特征在于，由所述权利要求1～6任一项所述的构建方法得到。
8.一种如权利要求7所述的用于测试肌肤敏感性的细胞模型在检测化合物、天然产物和药物对敏感肌肤ca2+离子内流情况中的应用。
9.一种如权利要求7所述的用于测试肌肤敏感性的细胞模型在检测天然产物提取物对细胞中trpv1离子通道表达中的应用。
10.一种用于检测筛选肌肤敏感性药物的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求7所述的用于测试肌肤敏感性的细胞模型来进行的。
