本发明属于细胞模型应用，具体涉及一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型及其应用。
背景技术：
1、痤疮，是一种较常见的慢性炎症性皮肤疾病，炎症反应是导致痤疮形成和发展的关键病理环节。核因子-kappab(nf-κb)是一种经典的可诱导转录因子，其调节参与炎症和急性期反应、免疫应答的多种基因的表达。在痤疮病理机制中，可检测到nf-κb通路的显著激活，此外紫外线辐射、dna损伤、和活性氧等多种刺激都会导致nf-κb通路。因此针对nf-κb通路的抗炎药物和天然产物筛选在痤疮治疗用品研发中具有重要意义。
2、在所报道的nf-κb检测相关文献中发现，目前nf-κb检测方法大致包括免疫组化、反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，rt-pcr)，上述共同存在的问题是检测步骤繁琐耗时，在快速高通量筛选检测药物和天然产物在皮肤细胞中抗炎活性药物中存在一定的局限性。免疫组化染色技术操作简单、敏感性高、特异性强，能将形态和抗原定位结合，但影响免疫组化的因素较多，对于石蜡切片，脱片问题即较为常见，可影响染色及结果的判断；而对于细胞爬片及涂片而言，操作过程繁琐、效率低、且片子处理过程容易带入很多误差，使得结果可比性差。rt-pcr技术灵敏度高、特异性高、自动化程度高等特点，还可以对模板进行定量，但荧光染料能与非特异的双链dna结合，容易产生假阳性信号，并且操作过程繁琐。诸如此类的技术局限性，有必要寻找更简洁且适合快速高通量筛选的检测方法，以适应现在高效的科研研究。
3、荧光素酶报告基因(luc)是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化oxyluciferin，在荧光素(luciferin)氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。
技术实现思路
1、基于上述存在的技术问题，本发明的第一目的在于提供一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，该方法是选择了hacat细胞(人永生化角质形成细胞)建模，利用基因工程技术将荧光素酶报告基因与nf-κb转录因子元件编辑融合，转入hacat细胞，构建hacat-nf-κb-luc稳转细胞模型，该模型即可通过荧光素酶报告基因方法评价nf-κb-luc水平，从而低成本、快速、高通量地筛选检测大量药物和天然产物在皮肤细胞中抗炎活性。
2、本发明的第二目的在于提供一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型，该模型使用慢病毒稳定转染hacat细胞获得过表达nf-κb细胞株，同时携带luc报告基因，方便检测nf-κb通路的激活情况。
3、本发明通过以下技术方案实现：
4、一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，包括如下步骤：
5、s1、利用plv表达载体构建nf-κb-luc慢病毒稳转质粒质粒，其中，所述nf-κb-luc的核苷酸序列如seq id no.1所示；
6、s2、plv-nf-κb-luc慢病毒包装质粒获得：
7、将所述s1中获得的慢病毒稳转质粒plv-nf-κb-luc利用大肠杆菌转化、无内毒素质粒提取后，获得慢病毒包装质粒plv-nf-κb-luc；
8、s3、hacat-nf-κb-luc稳转细胞株病毒模型的获得：
9、(1)使用离体的人胚肾细胞制造慢病毒，待细胞密度达到80％，留作备用；
10、(2)磷酸钙转染混合体系的配置：
11、将plv-nf-κb-luc质粒、慢病毒包装质粒和2.5m氯化钙混合，加去离子水至500μl，逐滴加入2×缓冲液混合制备成转染混合液；
12、(3)hacat-nf-κb-luc稳转细胞株病毒模型的获得：
13、将所述转染混合液加入到含有慢病毒细胞的培养皿中，并与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中培养，待转染混合液加入到慢病毒细胞中开始计时，48h后收集培养上清液，上清液经离心、膜过滤、分装后，得到hacat-nf-κb-luc稳转细胞株病毒模型。
14、作为优选地，所述s3中，慢病毒细胞在转染前2h更换新鲜预热的培养基；待更换完成后过2h，再配置磷酸钙转染混合体系；
15、所述新鲜预热的培养基为dmem培养基。
16、作为优选地，所述plv-nf-κb-luc质粒、慢病毒包装质粒、氯化钙、缓冲液的配置比为13.3μg：30μl：50μl：500μl。
17、作为优选地，加入到含有慢病毒细胞的培养皿中的所述转染混合液的量为1ml。
18、作为优选地，所述与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中放置16～18h后，更换10～15ml新鲜预热的培养基进行细胞继续培养；
19、所述新鲜预热的培养基为dmem培养基。
20、作为优选地，所述上清液经在2000～2500rpm下离心5～6min；采用0.45μm滤膜。
21、一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型，由所述的构建方法得到。
22、一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型在检测nf-κb通路的激活情况中的应用。
23、一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型在评价天然产物提取物、药物炎症水平中的应用。
24、一种快速、高通量筛选检测药物和天然产物在皮肤细胞中抗炎活性的方法，其特征在于，所述方法使用所述的基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型进行。
25、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
26、本发明提供了一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，该方法是选择了hacat细胞(人永生化角质形成细胞)建模，利用基因工程技术将荧光素酶报告基因与nf-κb转录因子元件编辑融合，转入hacat细胞，构建hacat-nf-κb-luc稳转细胞模型，该模型即可通过荧光素酶报告基因方法评价nf-κb-luc水平，从而低成本、快速、高通量地筛选检测大量药物和天然产物在皮肤细胞中抗炎活性。
27、该基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型使用慢病毒稳定转染hacat细胞获得过表达nf-κb细胞株，同时携带luc报告基因，方便检测nf-κb通路的激活情况。
1.一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，所述s3中，慢病毒细胞在转染前2h更换新鲜预热的培养基；待更换完成后过2h，再配置磷酸钙转染混合体系；
3.根据权利要求1所述的一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，所述plv-nf-κb-luc质粒、慢病毒包装质粒、氯化钙、缓冲液的配置比为13.3μg：30μl：50μl：500μl。
4.根据权利要求1所述的一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，加入到含有慢病毒细胞的培养皿中的所述转染混合液的量为1ml。
5.根据权利要求1所述的一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，所述与37℃下置于质量分数为5％的二氧化碳保温箱中放置16～18h后，更换10～15ml新鲜预热的培养基进行细胞继续培养；
6.根据权利要求1所述的一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型的构建方法，其特征在于，所述上清液经在2000～2500rpm下离心5～6min；采用0.45μm滤膜。
7.一种基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型，其特征在于，由所述权利要求1～6任一项所述的构建方法得到。
8.一种如权利要求7所述的基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型在检测nf-κb通路的激活情况中的应用。
9.一种如权利要求7所述的基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型在评价天然产物提取物、药物炎症水平中的应用。
10.一种快速、高通量筛选检测药物和天然产物在皮肤细胞中抗炎活性的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求7所述的基于nf-κb细胞信号通路的皮肤炎症细胞模型进行。
