本发明属于细胞生物学技术与应用，涉及氨基酸在调节gls1缺失的癌细胞增殖中的应用。
背景技术：
1、谷氨酰胺通过代谢和非代谢机制支持细胞存活、生长和增殖。在活跃增殖的细胞中，谷氨酰胺代谢成为乳酸，亦称为“谷氨酰胺分解(glutaminolysis)”，是呈nadph形式的能量的主要来源。谷氨酰胺分解中的第一步是谷氨酰胺脱氨基形成谷氨酸和氨，这被谷氨酰胺酶(gls)催化。因此，通过谷氨酰胺酶脱氨基是谷氨酰胺代谢的控制点，gls可以为癌症的治疗提供潜在的新靶标。在哺乳动物细胞中有两种类型的谷氨酰胺酶：肾型和肝型谷氨酰胺酶(gls1和gls2)，目前gls1的选择性抑制剂cb-839正在进行治疗三阴性乳腺癌、肺癌、肾癌和结直肠癌的临床试验，这表明抑制gls1会限制癌细胞的生长。
2、现有研究表明，一些非必需氨基酸的消耗能够起到抗癌作用，但在某些特殊情况下，氨基酸的消耗是否都能够抑制癌细胞的增殖尚不清楚；因此，本发明通过构建gls1缺失的癌细胞模型探究一些非必需氨基酸在gls1敲除/缺失的特殊情况下对癌细胞的作用，为一些特殊癌症的治疗提供重要的细胞研究基础。
技术实现思路
1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供氨基酸在调节gls1缺失的结直肠癌和乳腺癌细胞增殖中的应用。
2、为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
3、本发明第一方面提供了一种促进gls1缺失的癌细胞增殖的方法，所述方法包括如下步骤：向gls1缺失的癌细胞体系中添加有效量的非必需氨基酸。
4、术语“gls1”又称为谷氨酰胺酶1，是一种参与多种细胞过程的关键酶，其过度表达与癌症的发生和发展有关；其在癌细胞的代谢活动中起着至关重要的作用，促进快速增殖、细胞存活和免疫逃避。
5、在一些实施方案中，术语“有效量”是指减轻疾病或病况的至少一种或多种症状所需的治疗量，并且涉及提供所需效果的药物的足够量。在本发明中，术语“有效量”是指能够恢复/部分恢复gls1敲除对癌细胞增殖抑制作用的足够量。
6、术语“增殖”是指细胞经历细胞分裂的能力。可通过本领域已知的任何方法测量细胞的增殖能力，所述方法包括但不限于，用合适的生长因子刺激前后细胞的计数、荧光染料测定、将brdu掺入增殖细胞的dna、将放射性标记的类似物如3h-胸腺嘧啶掺入增殖细胞的dna和/或检测细胞增殖的细胞标志物。
7、在一些实施方案中，本发明所述的非必需氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸；在本发明的具体实施方案中，所述非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸。
8、在本发明中，上述方法步骤还可涵盖癌细胞的培养，所述癌细胞的培养包括如下步骤：使用含10％胎牛血清和50iu青霉素/链霉素的高糖dmem培养基，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
9、在本发明中，上述方法步骤还可涵盖gls1缺失的癌细胞模型的构建。
10、优选地，所述构建gls1低表达的癌细胞模型的方法包括：向癌细胞培养体系中加入抑制gls1表达或活性的试剂、将癌细胞gls1全基因敲除、在gls1蛋白中引入突变。
11、在一些实施方案中，本发明所述的抑制gls1表达的试剂包括但不限于：抑制gls1蛋白的编码基因的表达或降低该基因的表达水平、降低gls1蛋白活性的试剂，例如，抑制gls1基因表达或降低其表达水平的试剂，这些试剂包括但不限于：抑制gls1基因转录活性的试剂，抑制gls1 mrna转录水平的试剂，促进gls1 mrna降解的试剂，针对gls1基因的sirna，针对gls1基因的shrna，抑制gls1 mrna翻译的试剂，特异性识别gls1基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平的试剂，针对gls1基因的dsrna，针对gls1基因的微小rna，针对gls1基因的反义核酸。
12、术语“反义核酸”是指进行了某些化学修饰的短链核酸(由约15～25个核苷酸组成)，它的碱基顺序排列与特定的靶标序列互补，进入细胞后可按照watson-crick碱基互补配对的原则与靶标序列形成双链结构。
13、术语“sirna”是指能够抑制靶基因表达、包括正义rna片段区域和反义rna片段区域的核糖核酸(rna)。
14、在另外一些实施方案中，降低gls1蛋白活性的试剂可以是例如靶向gls1的特异性抗体或具有抑制gls1蛋白活性的小分子化合物。
15、在一些实施方案中，实现gls1全基因敲除的方法包括：利用基因同源重组进行基因敲除、利用随机插入突变进行基因敲除、rnai引起的基因敲除、tfos(triple helixforming oligonucleotides)引导的基因敲除术等。利用基因同源重组进行基因敲除的基本步骤包括基因载体的构建(把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的dna分子都重组到带有标记基因的载体上)、同源重组(将重组载体通过一定的方式导入细胞中，使外源dna与细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的dna序列整合到内源基因组中，从而得以表达)、选择筛选已击中的细胞(目前常用方法为正负筛选法、标记基因的特异位点表达以及pcr法)。利用随机插入突变进行基因敲除是指利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的t-dna转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。
16、在基因敲除过程中使用的特异性核酸酶包括锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应子核酸酶(talen)、cas9核酸酶、ngago核酸酶。锌指核酸内切酶由锌指蛋白dna结合结构域(此区域特异性地结合在dna目的区域)以及typeⅱs限制性内切酶的非特异性剪切结构域fokⅰ融合形成。转录激活物样效应子核酸酶(talen)依赖于不同数量的tale串联重复序列来识别和结合dna序列。每个tale重复序列由一组约34个氨基酸组成，其中包括约32个保守氨基酸和2个高度可变的氨基酸，称为重复变体二残基(rvd)。rvd将一个tale与另一个tale区分开来，并使tale拥有对蛋白质和dna碱基进行一对一识别的简单密码。基于此，talen可以特异性地、任意地识别和断裂dna位点，从而进行基因敲除。cas9核酸酶是一种rna引导的核酸内切酶，可与单链向导rna(single-guide rna，sgrna)形成稳定的核糖核蛋白复合物，识别和切割特定的核苷酸片段，从而进行基因敲除。ngago核酸酶利用引导dna(gdna)引导核酸内切酶ngago至目的序列，从而对目的基因进行剪切。在本发明的具体实施方案中，使用的特异性核酸酶为cas9核酸酶。
17、在本发明的具体实施方案中，使用crispr/cas9系统将gls1基因全敲除。其包括以下步骤：根据目标基因序列设计特定的单链引导rna(sgrna)；将sgrna和cas9编码序列克隆到适当的载体中；使用电穿孔、脂质体介导转染或病毒介导转导等方法将编辑载体导入目标细胞；筛选获得基因编辑效果的细胞；研究敲除基因后细胞的表型变化和功能影响。
18、在一些实施方案中，也可通过在gls1蛋白中引入突变而使其活性降低。在另一些实施方案中，在gls1蛋白的功能域中引入致其相应活性减弱或丧失的突变。突变可以是1个或数个甚至更多个(例如10个以上、20个以上、30个以上)氨基酸的插入、缺失或取代。可通过给予作用于gls1基因的试剂，使其所编码的gls1蛋白的功能域中存在导致其相关生物学活性减弱或丧失的突变。这类试剂可改变gls1基因的序列，导致其所编码的gls1蛋白存在相应的突变，从而具有减弱的活性或活性的丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的gls1基因替换野生型的gls1基因，从而导致表达弱活性或无活性的gls1蛋白。
19、进一步，所述癌细胞包括乳腺癌细胞、结直肠癌细胞。
20、进一步，所述乳腺癌细胞包括但不限于mcf-7，mcf-10a，mda-mb-231，mda-mb-435，mda-mb-435s，mda-mb-436，mda-mb-453，mda-mb-468，mda-mb-157，mda-mb-361，sk-br-3，sum159pt，t-47d，zr-75-30，zr-75-1，hs 578t，hcc1937，hcc 38，hbl100，bt-549，bt-474，bt-20，bcap-37，du4475等细胞株。
21、优选地，所述乳腺癌细胞选取mcf-7。
22、进一步，所述结直肠癌细胞包括hct116、sw480、dld-1、sw620。
23、优选地，所述结直肠癌细胞选取hct116。
24、进一步，当上述癌细胞为乳腺癌细胞时，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸。
25、优选地，所述谷氨酸、脯氨酸、精氨酸的有效量为0.5～10mm，所述天冬氨酸、丙氨酸的有效量为2mm。
26、进一步，当所述癌细胞为结直肠癌细胞时，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸。
27、优选地，所述谷氨酸、精氨酸的有效量为1～10mm，所述脯氨酸的有效量为0.5～10mm。
28、本发明第二方面提供了上述方法在制备治疗或预防gls1缺失但癌细胞增殖能力未受影响的癌症患者的药物中的应用。
29、术语“治疗或预防”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
30、术语“影响”是指以间接或无形的方式来作用或改变；在本发明中，“影响”是指gls1基因表达水平缺失对癌细胞增殖能力的作用。
31、进一步，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者。
32、进一步，所述药物制备后通过口服施用、栓剂施用、局部接触施用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
33、术语“施用”及类似术语指单次施用药物，以及术语“施用”也意在包括根据完整治疗方案或给药方案而施用药物。术语“施用”也意在包括药物不一定由相同用药途径或在相同时间施用的治疗方案。
34、在一些实施方案中，本发明所述药物根据需要可以制备成多种临床药物剂型以作为治疗gls1缺失但癌细胞增殖能力未受影响的癌症患者的药物，所述药物剂型包括但不限于：非肠道给药的剂型或者口服制剂，所述的非肠道给药剂型包括注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型；所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂。
35、在一些实施方案中，本发明所述药物的施用剂量是不受限制的，只要能够获得期望的治疗效果即可，可以依据受试者的症状、性别、年龄等来恰当地确定。本发明所述的药物的施用剂量可以使用例如对疾病的治疗效果作为指标来详细确定。
36、本发明的第三方面提供了上述方法在研究gls1缺失但癌细胞增殖能力未受影响的癌症患者患病机制中的应用。
37、术语“患病机制”是指疾病发生及其发展的过程，它涵盖了诸多层面，从分子、细胞、组织、器官到整个机体系统，以及与之相关的病因、遗传和环境等因素。本文使用的“患病机制”涵盖癌症发生及其发展的过程，包括但不限于癌症发生的因素及对机体产生的影响。
38、进一步，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者。
39、本发明的第四方面提供了gls1抑制剂与非必需氨基酸合成抑制剂的联合在治疗癌症患者中的应用，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者。
40、进一步，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸。
41、在本发明中，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”为开放式表达，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
42、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
43、本发明首次提出了非必需氨基酸在gls1缺失的特殊癌细胞中的作用。本发明将为特殊情况下的癌症患者即gls1缺失但癌细胞增殖能力并未受影响的患者的治疗提供理论实验模型基础，并提供了一种抗肿瘤联合用药的新途经，具有广阔的临床应用前景。
1.一种促进gls1缺失的癌细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：向gls1缺失的癌细胞体系中添加有效量的非必需氨基酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌细胞包括乳腺癌细胞和结直肠癌细胞；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述癌细胞为乳腺癌细胞时，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸；
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述癌细胞为结直肠癌细胞时，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸；
5.如权利要求1-4任一项所述的方法在制备治疗或预防gls1缺失但癌细胞增殖未受影响的癌症患者的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者；
7.如权利要求1-4任一项所述的方法在研究gls1缺失但癌细胞增殖未受影响的癌症患者患病机制中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者。
9.gls1抑制剂与非必需氨基酸合成抑制剂的联合在治疗癌症患者中的应用，其特征在于，所述癌症患者包括乳腺癌患者和结直肠癌患者。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述非必需氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸。
