本发明涉及牡丹快速培植，尤其涉及一种‘凤丹’组培快繁及高效再生的方法。
背景技术：
1、牡丹为芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia l.)多年生落叶灌木，具有很高的观赏价值和经济价值，素有国花之称。油用牡丹是高结实率、含油率，可作为油料作物栽培的牡丹，是集观赏、药用、食用等多产业为一体的类型，其生产的牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸、微量元素以及生物活性物质，具有降血脂、血糖，提高人体免疫力等保健功能。‘凤丹’(p.ostii‘fengdan’)是油用牡丹的主要栽培品系之一，其花量大、萌蘖少，结籽量大、出油率高、适应性广、生长势强。
2、目前，‘凤丹’的繁殖还是主要依赖于播种繁殖，存在繁殖周期过长，且受季节及环境限制，此外后代性状差异较大，不易于保持母本优良性状，丢失高油量、高油质的品质。‘凤丹’也可以采用扦插、嫁接、分株方式进行繁殖，其中，扦插繁殖存在生根率低、材料易腐坏等问题；嫁接繁殖常受限于砧木接穗亲和性及其生长周期、环境季节等问题；分株繁殖则会导致缓苗期过长、生长状态较弱，且常会造成根系伤口裸露引起感染烂根。
3、对比以上传统方式存在的繁殖系数低、成苗周期长且质量参差不齐等问题，建立‘凤丹’组培快繁及高效再生技术体系，具有不受季节及环境限制、缩短育种周期、保持亲本优良品质等优点，有利于其工厂化生产。相关领域的研究人员已经对‘凤丹’组培快繁及高效再生方法进行了一定的摸索，但仍存在以下缺陷：
4、(1)组培苗的诱导率、增殖率、生根率低，导致‘凤丹’快繁及再生效率及增殖系数低；
5、(2)‘凤丹’组培苗存在褐化问题，影响组培苗的生长发育，生根率低、生根状态不好、存活率低；
6、(3)再生体系单一，集中在腋芽或顶芽的直接器官发生，影响再生效率及增殖系数；
7、(4)组培苗生长缓慢，培育周期长。
8、综上所述，研发一种适用于‘丹凤’的组培快繁及高效再生的方法很有必要。
技术实现思路
1、鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种‘凤丹’组培快繁及高效再生的方法，用以解决现有组培苗的诱导率、增殖率、生根率低，导致‘凤丹’快繁及再生效率及增殖系数低；‘凤丹’组培苗存在褐化问题，影响组培苗的生长发育，生根率低、生根状态不好、存活率低；再生体系单一，组培苗生长缓慢，培育周期长等问题中的至少一个。
2、本发明公开了一种‘凤丹’组培快繁及高效再生的方法，其特征在于，所述方法包括s1启动培养、s2增殖培养和s3生根培养；
3、其中，步骤s1采用的启动用培养基包括nn69和iba；步骤s2采用的增殖用培养基包括nn69、cppu和iba。
4、上述方法具体包括以下步骤：
5、s1启动培养：制备启动用培养基，所述启动用培养基包括nn69+iba；将经升汞和酒精灭菌后的带叶腋茎段外植体接种到启动用培养基上，进行启动培养，获得初代腋芽和初代叶片；其中，初代叶片经诱导和分化后获得分化后的不定芽；
6、s2增殖培养：制备增殖用培养基，所述增殖用培养基包括nn69+iba+cppu+pvp；将初代腋芽或分化后的不定芽接种到增殖用培养基上，进行增殖培养，获得未生根的组培苗；
7、s3生根培养：配置生根用培养基，采用一步生根法或两步生根法对未生根的组培苗进行生根培养，获得完整的组培苗。
8、具体的，所述启动用培养基中iba浓度为0.1～0.2mg/l，优选为0.1mg/l。
9、具体的，所述增殖用培养基中iba浓度为0.1～0.2mg/l，cppu浓度为0.2～0.6mg/l，pvp浓度为4mg/l；优选为iba浓度为0.1mg/l，cppu浓度为0.4mg/l。
10、进一步的，所述初代叶片诱导和分化的具体操作为：
11、s1-1诱导培养：配置诱导用培养基，所述诱导用培养基包括nn69+iba+cppu+pvp，将初代叶片接种到诱导用培养基上，进行诱导培养，获得愈伤组织；
12、s1-2分化培养：配置分化用培养基，所述分化用培养基包括nn69+iba+cppu+pvp，将愈伤组织接种到分化用培养基上，进行分化培养，获得分化后的不定芽。
13、优选的，所述诱导用培养基中iba浓度为0.3mg/l，cppu浓度为0.9mg/l，pvp浓度为3mg/l；所述分化用培养基中，iba浓度为0.2mg/l，cppu浓度为0.2mg/l，pvp浓度为3mg/l。
14、进一步的，所述方法还包括s2.5壮苗培养步骤，所述壮苗培养步骤设置在s2增殖培养之后，s3生根培养之前；
15、具体操作为，完成s2增殖培养后，对未生根的组培苗施加光照并进行壮苗培养，获得粗壮、抽长的未生根的组培苗用于后续生根培养。
16、进一步的，所述光照条件为：led光源组合为混合全光谱白光与红光w:r＝7:1，光照强度为w＝26.25μmol·m-2s-1，r＝3.75μmol·m-2s-1，其中w和r分别表示全光谱白光和红光；或，全光谱白光50μmol·m-2s-1。
17、进一步的，步骤s3中一步生根法的具体操作为，将未生根的组培苗接种入生根培养基进行生根培养，生根培养基的组成为nn69+3mg·l-1cacl2或nn69+3mg·l-1cacl2+0.2mg·l-1iba。
18、进一步的，步骤s3中两步生根法的具体操作为：
19、将未生根的组培苗冷处理后接种入根形成用培养基进行培养，所述根形成培养基组成为nn69+3mg·l-1cacl2+0.2mg·l-1iaa，获得初步生根的组培苗；
20、将初步生根的组培苗转入根伸长用培养基中进行培养，所述根伸长用培养基组成为nn69+6mg·l-1cacl2或nn69+6mg·l-1cacl2+0.2mg·l-1iba，最终获得完整的组培苗。
21、与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
22、1、本发明以‘凤丹’带芽茎段为外植体，经过启动(含诱导、分化)、增殖、生根等步骤成功地获得了‘凤丹’组织培养再生植株，同时通过叶片愈伤组织诱导及分化的间接器官发生途径，建立了系统的‘凤丹’再生体系。具有组培苗增殖系数高、成苗率高、成本低、收益大等优点，利用植物组织培养技术提高其繁殖速度和规模，实现‘凤丹’种苗的工厂化生产。
23、本发明优化了‘凤丹’基本培养基种类，首次使用了nn69进行牡丹类植株的培养，突破仅使用ms、wpm两大类困境。牡丹是芍药科芍药属的植物，芍药属本身为草本属，而牡丹为灌木(木本)，木质组织较为丰富，因此现有技术中适用于芍药属的培养基，用于培养牡丹往往效果不佳。本发明中的nn69培养基常用于梨属等果树的基本培养基，本发明开创性地将其首次应用于牡丹培育体系中，并以此为基体进一步开发了适合牡丹(尤其是凤丹)的组合培养基类型；nn69基体在培育过程中起到了增加分化率、降低褐化率的作用，并在后续增殖及生根也提供了很好的培养条件。
24、本发明采用生长调节剂iba进行启动培养并采用生长调节剂iba+cppu的组合进行其他环节，突破了从6-ba、kt、tdz、zt几大类生长调节剂中选型的传统思路。在开发过程中，研发人员通过理论推导和实验论证突破了以下技术难点：
25、(1)对于‘凤丹’不同外植体或器官来说，对于生长调节剂的响应是不同的，如s1启动培养中的实验数据可知，添加了iba的nn69培养基具有最高的增殖系数，优于iba+cppu的组合，因此在本环节的研发中易得出iba+cppu的组合不适配于‘凤丹’培育的错误结论；但是从后续步骤的实验数据可知，对于初代叶片、分化的不定芽、初代腋芽以及愈伤组织来说，iba+cppu组合的效果优于iba单独使用。
26、(2)对于‘凤丹’不同外植体或器官来说，相同的生长调节剂组合，最佳浓度区间相差很大；如s2增殖培养中的实验数据可知，中低浓度的iba+cppu组合对于腋芽或不定芽具有更高的增殖系数，高浓度的组合反而对增殖效果有害，导致在其他环节的推测或设计中，容易得到中低浓度的iba+cppu组合更适用于‘凤丹’培养的误导；
27、然而，对于步骤s1中的诱导和分化来说，中低浓度的iba配合较高浓度的cppu对初代叶片具有较好的诱导效果、中低浓度的iba配合较低浓度的cppu对愈伤组织具有较好的分化效果；也就是说不同分化程度或形态的器官或外植体，生长调节剂组合的效果曲线不同，拐点不同，最优浓度组合及优选区间存在较大差别，难以预计和推测。
28、(3)生根培养步骤中的两步生根法打破了传统思路，获得了更高的生根率(70％以上)，可有效解决牡丹组培苗生根率低、根系状态不好、移栽存活率低等问题。
29、2、本发明构建了牡丹组织愈伤再生体系(对应步骤s1中诱导和分化)，为遗传转化体系提供基础。目前大量研究未能对‘凤丹’愈伤组织有良好的诱导及分化效果，降低了增殖系数及遗传转化体系的构建，此次研究不仅提供了愈伤组织的诱导及分化配方，并且获得了很好的诱导率和分化率，对于牡丹的再生体系进一步重大优化。此外，由于利用了初代叶片进行进一步增殖，有效提高了增殖系数。
30、3、本发明对组培扩繁过程中光照培养条件进行了研究，提供了新的培养思路与选择。目前‘凤丹’组培缺少培养条件的探索，且多使用传统led人工光源，本研究首次发现50μmol·m-2s-1全光谱白光照射可以使茎叶健壮、提高增殖系数；混合红光与全光谱白光w:r＝7:1可以使试管苗具有主干性，显著趋向于形成完整植株。因此，本发明提供了依据不同需求选择不同光照培养条件的技术方案。
31、本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。
1.一种‘凤丹’组培快繁及高效再生的方法，其特征在于，所述方法包括s1启动培养、s2增殖培养和s3生根培养；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述启动用培养基中iba浓度为0.1～0.2mg/l。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述增殖用培养基中iba浓度为0.1～0.2mg/l，cppu浓度为0.2～0.6mg/l。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初代叶片诱导和分化的具体操作为：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导用培养基中iba浓度为0.3mg/l，cppu浓度为0.9mg/l；所述分化用培养基中，iba浓度为0.2mg/l，cppu浓度为0.2mg/l。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括s2.5壮苗培养步骤，所述壮苗培养步骤设置在s2增殖培养之后，s3生根培养之前；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光照条件为：
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s3中一步生根法的具体操作为，将未生根的组培苗接种入生根培养基进行生根培养，生根培养基的组成为“nn69+3mg·l-1cacl2”或“nn69+3mg·l-1cacl2+0.2mg·l-1iba”。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s3中两步生根法的具体操作为：
