本发明属于病原检测，具体涉及一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂及其制备方法。
背景技术：
1、人类免疫缺陷病毒(hiv)是艾滋病的病原体，它是一种逆转录病毒，可分为hiv-1型和hiv-2型。当机体感染hiv数周到半年后，绝大多数患者体内可出现抗hiv抗体。hiv侵入人体后主要攻击人体辅助t淋巴细胞系统，一旦侵入机体细胞，就会导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存。hiv抗体检测可以用于诊断hiv感染，早期检测和治疗可以有效控制病情进展，减少并发症和传播风险。
2、梅毒螺旋体是梅毒(syp)的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体。梅毒螺旋体只感染人类，分为获得性梅毒与胎传梅毒。获得性梅毒主要通过性接触传播。胎传梅毒由梅毒螺旋体通过胎盘，从脐带血循环传给胎儿，可引起胎儿全身感染；螺旋体在胎儿内脏及组织中大量繁殖，可引起胎儿死亡或流产。梅毒螺旋体抗体检测可以用于诊断梅毒感染，及时治疗可以防止疾病进展和并发症的发生，同时也有助于预防感染的传播。
3、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hbv)引起的世界性传染病。乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)检测可以用于早期诊断乙型肝炎病毒感染，及时采取措施进行治疗和预防，以减少疾病的进展和并发症的发生。
4、丙型病毒性肝炎简称丙型肝炎，是由丙型肝炎病毒(hcv)引起的。根据who公布的资料，全世界目前已有1.7亿hcv感染者，全球hcv的感染率约为3％，丙型肝炎病毒抗体检测可以用于诊断丙型肝炎病毒感染，早期发现和治疗可以减少肝炎病情的恶化和肝硬化、肝癌等并发症的发生。
5、上述四种病原体在传播途径上都存在着性传播、母婴传播、血液传播等途径，这使得检测人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒有着一定的临床意义。
6、目前随着科技的发展，四种病原体检测方法有pcr检测、酶联免疫检测、免疫印迹、化学发光、免疫层析等，除免疫层析外，其余检测方式需要专业人员操作且需要相关设备，不能满足基层的检测。免疫层析操作简单，且利于大量样本的检测；故本发明主要是建立一种胶体金层析技术，以实现同时检测hiv抗体、syp抗体、hbv抗原及hcv抗体的目的。
技术实现思路
1、
2、本发明旨在基于胶体金层析技术，开发一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原及hcv抗体联合检测试剂和试剂盒。
3、本发明的技术方案具体如下：
4、本发明第一方面提供了一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，包括至少一个层析体系，每个层析体系均由底板、吸水垫、样品垫、金标垫和层析介质组成；其中，样品垫由样品垫处理液浸泡后干燥所得，样品垫处理液为包含0.3～0.5mg/ml酪蛋白钠、5～10mg/ml牛血清白蛋白、0.3～0.5mg/ml红细胞(rbc)、0.5～2.0mg/ml主动阻断剂、1～1.5％w/v s9、0.3～0.6％v/v吐温-20、0.3～0.6％v/v吐温-80的100～200mm硼酸盐缓冲液，且其ph为9.0-10.0。
5、优选地，在上述联合检测试剂中，样品垫处理液还包含0.1～0.3％w/v聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)、0.3～0.6％w/v edta二钠及0.05-0.2％v/v pc300。
6、优选地，在上述联合检测试剂中，金标垫依次经结合垫处理液和复溶液处理后干燥所得，其中，结合垫处理液为包含1～5％w/v蔗糖、0.1～0.5％w/v酪蛋白、0.1～0.5％w/vpvpk30、0.1～1％w/v s9的10～100mm pb缓冲液，且结合垫处理液的ph为7.0～8.0；复溶液为包含1～5％w/v蔗糖、1～3％w/v牛血清白蛋白、0.1～0.5％w/v pvpk30、1～3％v/v吐温-20的10～50mm tris缓冲液，且复溶液的ph为8.0～9.0。
7、优选地，在上述联合检测试剂中，包括3个层析体系，第一层析体系用于检测hiv抗体、syp抗体，第二层析体系用于检测hbv抗原，第三层析体系用于检测hcv抗体。具体的，第一层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鼠igg的质控线、包被有hiv抗原的第一检测线和包被有syp抗原的第二检测线，第二层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鸡igy的质控线以及包被有hbsag检测用抗体的检测线，第三层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鸡igy的质控线以及包被有hcv抗原的检测线。
8、本发明基于胶体金层析技术开发检测试剂，其原理为：利用胶体金与蛋白质(抗原/抗体)的结合，检测到待测物后与硝酸纤维素膜(nc)膜上的包被蛋白形成夹心结构后达到检测目的。然而，在前期开发中发现，使用某一缓冲液(如tris或磷酸盐缓冲液)配合糖(蔗糖或海藻糖)的加入，另外加入表面活性剂配制结合垫处理液及金标复溶液，与本体系标记后的金进行混合后，会出现层析背景偏红，灵敏度不够的问题；而且使用全血、血清、血浆常用的tris缓冲液处理样品垫后，配合本体系进行使用，发现全血样本会出现溶血现象。针对上述问题，发明人通过大量试验探索，一方面通过样品垫中外加主动阻断剂(可以阻断和减少待测样品中可能导致错误结果和不正确诊断的蛋白干扰和影响，具体可以为hier/hbr系列阻断剂)及表面活性剂混合液的方式，另一方面通过两种不同缓冲体系处理金标垫，有效解决了上述问题，进而实现了不同样品形式(包括全血、血清、血浆)下4种病原的联合检测，检测灵敏度高且结果可靠。
9、本发明第二方面提供了一种检测试剂盒，其包含本发明提供的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂；优选地，还包含用于保护和固定检测试剂的卡壳、以及样本稀释液，样本稀释液具体为含有0.05％～0.2％v/v吐温-20的1×pbs溶液。可以理解的是，检测试剂盒中还可以包括滴管等耗材。
10、本发明第三方面提供了一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
11、采用样品垫处理液浸泡处理样品垫，干燥即得样品垫；
12、采用结合垫处理液浸泡预处理结合垫，干燥；用复溶液重悬金标蛋白后，均匀铺于与处理后的结合垫上，干燥即得金标垫；
13、将质控线和检测线制备于nc膜上即得层析介质；
14、将所得样品垫、金标垫、层析介质和吸水垫依次搭建在底板上，即得层析体系。在上述方法中，金标蛋白的制备方法为：先将胶体金与目标蛋白反应，再用封闭液处理；其中，目标蛋白包括人类免疫缺陷病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗原、鼠igg抗体、鸡igy抗体，封闭液包含酪蛋白钠和bsa。
15、在本发明的联合检测试剂中，层析体系可以为1个、2个、3个或4个；如在本发明的一些实施例中，层析体系有3个，即前述的第一层析体系、第二层析体系和第三层析体系。可以理解的是，层析体系间的区别在于金标垫(具体为金标蛋白不同)和层析介质(具体为检测线和质控线包被蛋白不同)。
16、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
17、(1)本发明提供的检测试剂可以实现人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及梅毒螺旋体的同时检测，且覆盖了现有人类免疫缺陷病毒所有型别，即对于人类免疫缺陷病毒，通过使用hiv-1和hiv-2融合抗原进行金标记，并用hiv-1+hiv-2抗原混合液进行包被以达到hiv所有型别均可检出的目的。
18、(2)对于结合垫处理液及金标后产物复溶液，通过选择不同的缓冲体系配合使用以稳定体系，达到金颗粒完全释放的效果，以有效保证层析结果。
19、(3)针对本联合检测项目中全血/血清/血浆层析过程的非特异问题及全血层析溶血问题，本发明开发了一种适配的样品垫处理液配方，通过样品垫中外加主动阻断剂及表面活性剂混合液的方式，使检测试剂具有较高的特异性且检测全血样本不溶血，血清血浆样本背景干净。
20、(4)本发明提供的检测试剂不仅检测限低，而且检测结果准确可靠，具有临床大规模应用潜力。
1.一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，包括至少一个层析体系，所述层析体系包括底板、吸水垫、样品垫、金标垫和层析介质；其中，样品垫由样品垫处理液浸泡后所得，所述样品垫处理液为包含0.3～0.5mg/ml酪蛋白钠、5～10mg/ml牛血清白蛋白、0.3～0.5mg/ml rbc、0.5～2.0mg/ml主动阻断剂、1～1.5％s9、0.3～0.6％吐温-20、0.3～0.6％吐温-80的100～200mm硼酸盐缓冲液，且其ph为9.0-10.0。
2.根据权利要求1所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，所述样品垫处理液还包含0.1～0.3％pvpk30、0.3～0.6％edta二钠及0.05～0.2％pc300。
3.根据权利要求1所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，所述金标垫依次经结合垫处理液和复溶液处理后所得，其中结合垫处理液为包含1～5％蔗糖、0.1～0.5％酪蛋白、0.1～0.5％pvpk30、0.1～1％s9的ph 7.0～8.0 10～100mmpb缓冲液，复溶液为包含1～5％蔗糖、1～3％牛血清白蛋白、0.1～0.5％pvpk30、1～3％吐温-20的ph 8.0～9.0 10～50mm tris缓冲液。
4.根据权利要求1所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，包括3个层析体系，其中第一层析体系用于检测hiv抗体、syp抗体，第二层析体系用于检测hbv抗原，第三层析体系用于检测hcv抗体。
5.根据权利要求4所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，所述第一层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鼠igg的质控线、包被有hiv抗原的第一检测线和包被有syp抗原的第二检测线，所述第二层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鸡igy的质控线以及包被有hbsag检测用抗体的检测线，所述第三层析体系的层析介质上设有包被有羊抗鸡igy的质控线以及包被有hcv抗原的检测线。
6.根据权利要求5所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂，其特征在于，所述hiv抗原由hiv-1型抗原和hiv-2型抗原组成。
7.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，包括样本稀释液，所述样本稀释液为含有0.05％～0.2％吐温-20的1×pbs溶液。
9.一种hiv抗体、syp抗体、hbv抗原、hcv抗体联合检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述金标蛋白的制备方法为：将胶体金与目标蛋白反应后用封闭液处理，其中目标蛋白包括人类免疫缺陷病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗原、鼠igg抗体、鸡igy抗体，所述封闭液包含酪蛋白钠和bsa。
