本发明涉及生物医药，更具体的说是涉及一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法及其应用。
背景技术：
1、癌症不仅仅是一系列生物学事件的结果，而是一个复杂的、多因素驱动的疾病过程。它涉及肿瘤细胞、肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)、宿主代谢和免疫系统等多个方面的相互作用。这些因素共同作用，影响癌症的发生、发展和治疗响应。巨噬细胞(raw264.7)是高度可塑性的天然免疫细胞，也是tme的主要组成部分，是使机体长期保持自身免疫平衡状态的最主要原因。tme是免疫细胞和癌细胞相互作用的关键场所，是肿瘤生存、发展和免疫逃避的肥沃土壤。免疫反应是机体抵抗肿瘤的天然屏障，免疫效应失衡是肿瘤发生和发展的主要原因。免疫系统在癌症中发挥着双重作用：一方面，它是抵御肿瘤细胞的守护者，另一方面，癌症细胞能够操纵免疫系统以促进自身的存活。
2、结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，好发于中老年人群，呈逐年上升的趋势。由于结直肠癌患病早期缺乏特异性症状，导致早期诊断率较低，多数患者在确诊时已发展至中晚期，增加了根治性手术的治疗难度，影响病情预后，严重影响患者生存寿命。手术是目前治疗结直肠癌的主要措施，适用于早、中期患者，术后结合放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及中医药治疗等综合治疗，而晚期患者手术疗效较差，且对机体免疫功能影响较大，导致消化系统、免疫系统等出现明显的不良反应，严重影响结直肠癌患者生活质量。
3、菲律宾蛤仔(ruditapes philippinarum)广泛分布于辽宁、山东、福建等南北海区，是重要的优质海洋资源，具有肉质鲜美、营养价值丰富、高蛋白且低脂肪等特点。目前，菲律宾蛤仔主要以生鲜形式销售，少部分加工成罐头等形式，产品附加值低。我国传统中医理论(明代《神农本草经疏》，又名《本草经疏》)认为，蛤肉有滋阴明目、强壮滋补、利尿通淋、软坚散结、化痰等功效；菲律宾蛤仔亦可入药，《中华海洋本草》中也记载其药效。现今已有大量研究报道，菲律宾蛤仔富含多肽、多糖、糖胺聚糖、糖蛋白等生物活性物质，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抑菌、抗凝血等活性。研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和提高免疫等多种功效，已成为多糖提取领域当前研究和开发的热点，而关于海洋源的酶解蛤蜊多糖的抗肿瘤和免疫调节活性功能研究却鲜见报道。此外，与药物相比，食物来源的活性多糖具有无毒、更易吸收且免疫原性更低的优势。
4、经过检索发现，有两篇与本发明相关的公开专利文献：(1)“四角蛤蜊糖胺聚糖在制备抗血栓药物或保健品上的应用”(cn201510863895.6)提供了一种四角蛤蜊糖胺聚糖在抗血栓药物或保健品上的应用。属蛤蜊肽在抗血栓领域的功能应用。(2)“四角蛤蜊糖胺聚糖的提取制备方法”(cn201010261457)，提供了一种四角蛤蜊糖胺聚糖的提取制备方法。属蛤蜊糖胺聚糖的制备工艺。通过对比，上述公开专利文献的技术方案及应用领域与本发明有本质不同，且目前尚未有高纯度蛤蜊多糖在抗肿瘤和免疫调节功能方面的应用，尤其是对结直肠原位瘤的抑制作用以及增强机体免疫力。
5、因此，提供一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法及其应用，目的在于采用菲律宾蛤仔制备高纯度蛤蜊多糖，将其用于抗肿瘤、免疫调节活性功能方面，具体可应用到抗肿瘤和免疫调节功能药物中，以及有相关功能的保健食品中。
2、本发明填补了高纯度抗肿瘤蛤蜊多糖的制备工艺以及抗肿瘤和免疫活性功能方面的应用空白。
3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
4、一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法，具体步骤如下：
5、(1)以菲律宾蛤仔整肉为原料，清洗后加纯水匀浆，得到原料：纯水＝1：2～3的蛤蜊肉浆，调节其ph为7.8～8.5，设定酶解温度为37～38℃，加入原料重量0.03％～0.05％的胰蛋白酶，酶解3～5h后，进行酶灭活处理，得到酶解液；所述胰蛋白酶酶活力为2500u；
6、(2)将步骤(1)所得酶解液离心，弃沉淀，上清液经10μm微滤膜(材质pp)和300kda超滤膜(材质pes)过滤，截留大于300kda分子量段，得到截留酶解液；
7、(3)步骤(2)所得截留酶解液加入乙醇至含醇量为75～82％，搅拌1～2h后，静置18～24h，分离上清液和沉淀，将沉淀以纯水复溶后，减压浓缩(压力-0.08～-0.1mpa，加热温度30～60℃)，浓缩液离心，弃沉淀；离心上清液再加入乙醇至含醇量为65～73％，搅拌(搅拌1～2h)、静置(静置18～24h)、弃上清、复溶沉淀、浓缩；浓缩液再加入乙醇至含醇量为55～60％，重复上述操作；浓缩液经冷冻干燥或者喷雾干燥，得高纯度蛤蜊多糖。
8、进一步，步骤(1)所述酶灭活处理为80～100℃处理15～20min。
9、进一步，步骤(2)所述离心为5000rpm离心20min。
10、进一步，步骤(3)所述离心为4000rpm离心20min。
11、进一步，所述的提取纯化生产方法制备得到的高纯度蛤蜊多糖。
12、进一步，所述的高纯度蛤蜊多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
13、进一步，所述肿瘤为结肠直肠癌、胃癌。
14、进一步，所述的高纯度蛤蜊多糖在制备免疫调节药物中的应用。
15、进一步，所述药物为口服、注射或外用剂型。
16、采用胰蛋白酶-膜耦合-醇沉技术，通过酶解、离心、纯化精制、干燥等加工技术，生产的一种色泽、口感具佳，具有抗肿瘤和增强免疫功能，且易于人体吸收的蛤蜊多糖，可用于抗肿瘤药物及相关功能的保健品的制备，以实现蛤蜊肉的高值化利用。
17、高纯度蛤蜊多糖经离子交换层析和凝胶色谱层析的分离纯化，得到精制蛤蜊多糖，得率0.98％以上，总糖含量达到95％以上。分析了所述的精制蛤蜊多糖的分子量及结构，结果表明，蛤蜊多糖具有两个主要成分，分子量分别为215wda和46wda，其单糖主要组成均为葡萄糖；主要结构为主链以α-1，4糖苷键连接、支链与主链以α-1，6糖苷键连接的葡聚糖。
18、所述的高纯度蛤蜊多糖对人结肠癌细胞(ht-29)和胃癌细胞(mgc-803)活力有明显的抑制作用，促进诱导肿瘤细胞凋亡的效果显著，实现直接抗肿瘤的效果。
19、所述的高纯度蛤蜊多糖可促进巨噬细胞吞噬活性、增强细胞活力，并且上调巨噬细胞中cd86、tnf-α和inos因子的表达，调节巨噬细胞免疫活性，实现抗肿瘤的效果。
20、所述的蛤蜊多糖在斑马鱼肿瘤移植模型体内发挥良好的抑制肿瘤细胞生长和转移、促进细胞凋亡和抑制血管新生效果，同时能上调bax、ifng1和tnf-α基因表达，下调vegfaa基因表达。
21、所述的蛤蜊多糖在结直肠炎症原位肿瘤模型小鼠体内发挥良好的抗肿瘤作用和调节免疫效应。有效缓解了结直肠病变症状，同时显著降低il-1β、cea、lps含量等，显著降低因肿瘤导致的cox-2、ki67和pcna的高表达，有效抑制肿瘤的扩散和生长。
22、所述的蛤蜊多糖应用不局限于结肠直肠癌抑制肿瘤、辅助治疗和免疫力调节，也适用于其他肿瘤抑制和辅助治疗及提高机体免疫力。
23、所述的蛤蜊多糖可用于抗肿瘤药物及提高免疫力功能药物的制备，且可以为药剂学上允许的任何剂型，包括口服(粉剂、片剂、胶囊、口服液等)、注射和外用剂型。
24、所述的蛤蜊多糖可作为直接抗肿瘤治疗药物，以及辅助抗肿瘤和增强免疫力相关保健食品中的组成成分。
25、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法及其应用，具有以下有益效果：
26、(1)高纯度蛤蜊多糖通过体外细胞试验证实具有对人结肠癌细胞(ht-29)和胃癌细胞(mgc-803)活力有明显的抑制作用和显著的促进凋亡的效果，实现直接抗肿瘤的功效；以及，促进巨噬细胞吞噬活性，增强细胞活力，调节巨噬细胞免疫活性的作用，实现抗肿瘤的效果。
27、(2)高纯度蛤蜊多糖通过斑马鱼试验证实具有显著的抑制肿瘤细胞生长、转移，促进细胞凋亡，抑制血管新生的功效，同时能上调bax、ifng1和tnf-α基因表达，下调vegfaa基因表达。
28、(3)高纯度蛤蜊多糖通过试验证实具有良好的缓解结直肠病变的症状，能够释放众多的抗肿瘤因子，有效抑制肿瘤的扩散和生长，同时降低因肿瘤导致的cox-2、ki67和pcna等的高表达。
29、(4)本发明开拓了高纯度蛤蜊多糖新的医疗和保健用途，具有安全性高、易被吸收的特点，为广大患者提供了一种抗肿瘤和调节免疫功能的食源性药物选择。
1.一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法，其特征在于，步骤(1)所述酶灭活处理为80～100℃处理15～20min。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法，其特征在于，步骤(2)所述离心为5000rpm离心20min。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤蛤蜊多糖的提取纯化生产方法，其特征在于，步骤(3)所述离心为4000rpm离心20min。
5.权利要求1-4任一项所述的提取纯化生产方法制备得到的高纯度蛤蜊多糖。
6.权利要求5所述的高纯度蛤蜊多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠直肠癌、胃癌。
8.权利要求5所述的高纯度蛤蜊多糖在制备免疫调节药物中的应用。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为口服、注射或外用剂型。
