本发明属于酶工程，尤其涉及一种bap4h突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、脯氨酸羟基化是胶原蛋白中最普遍的翻译后修饰。由此产生的产物反式-4-羟脯氨酸(hyp)对胶原蛋白的稳定性和功能至关重要，有研究表明胶原蛋白中脯氨酸羟基化的缺乏会使三螺旋结构不稳定从而影响与整合素的结合。4-脯氨酸羟化酶(prolyl 4-hydroxylases，p4hs)是一类依赖于亚铁离子和2-酮戊二酸的氧化酶，可催化hyp形成。来自炭疽杆菌(bacillus anthracis)的p4h(bap4h)，可修饰胶原蛋白样富含脯氨酸的肽。
2、胶原蛋白的三股螺旋结构中含有丰富的高度重复的三肽基序：gly-x-y，其中x和y位置常为脯氨酸和羟脯氨酸。在体内，x位置上的脯氨酸需要进行羟基化修饰生成4-羟脯氨酸(4-hydroxyproline)，形成稳定的胶原蛋白三螺旋结构。
3、目前，胶原蛋白基因和p4hs基因在酵母中共表达取得了一定的进展，以实现在工业化的表达系统中产生羟基化修饰的胶原蛋白。但野生型p4hs存在表达量低，对胶原蛋白的羟化效率较低，羟化后的重组胶原蛋白稳定性未改善等问题。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了bap4h突变体，实验结果表明所述突变体能高效羟化重组胶原蛋白，增强了重组胶原蛋白的稳定性。
2、本发明的第一个目的是提供一种bap4h突变体，是在seq id no.1所示的氨基酸序列上进行突变，包含缺失与取代。
3、优选地，所述修饰的位置及其突变前后氨基酸选自以下任一项：
4、由以下组成的组：n3s、n4s、n5s、i7m、g8n、e9r、n10e、k11i、e12k、t14e、i15r、d17a、h18d、k19d、g20e、n21s、i23h、k24t、t25a、e26r、d27缺失、r28k、e29a、i30f、i32缺失、i33缺失、s34e、k35g、e37s、e38n、l40m、i41p、l44y、g45y、n46a、l48s、s49e、d50a、e51w、e52缺失、d54a、e55v、l56n、i57k、e58w、l59q、s60a、k61缺失、s62e、k63l、l64t、a65n、r66p、s67a、k68a、g70t、s71l、s72缺失、r73t、d74a、n76s、d77p、i78a、r79a、r79t、r79s、r79l、s81l、s82缺失、g83n、a84t、l86k、d87k、d88v、n89e、e90s、l91v、t92m、a93d、k94l、i95v、e96m、k97q、r98s、i99d、s100缺失、s101a、i102a、n104q、a107t、s108k、h109l、g110s、e111m、g112a、l113a、h114d、i115e、l116缺失、n117s、e119k、d121g、k125y、a126w、h127l、d129k、a132q、e133v、h134t、h134d、h134s、h134k、s135n、r136e、s137m、a138n、a139r、n140s、n141e、r142e、i143s、s144v、t145d、l146k、l150y、n151q、d152g、e154a、e155s、g156n、g157m、e158a、t159d、k163s、l164v、n165w、l166q、s167h、h169i、r171i、k172a、g173r、a175t、e179p、d184w、s186f、l187k、n188a、e189v、l190i、t191p、l192g、h193a、g194m、g195缺失、a196c、t199s、k200v、g201m、e202q、i205v、a206k、t207s、r211a、r212y、g213p、t214q和e217n以及其组合。
5、更优选地，所述突变体其中各修饰独立地为取代或缺失，其中所述变体与seq idno.1的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
6、本发明的第二个目的是提供所述bap4h突变体的表达体系，包括但不限于核酸分子、重组表达载体、重组细胞。
7、优选地，所述的核酸分子包含编码所述的bap4h突变体的核苷酸序列或其互补序列。
8、优选地，所述的重组表达载体含有所述的核酸分子。所述表达载体包括衍生自任何来源并且能够基因组整合或自主复制的任何核酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链dna或rna核酸分子)，其包含已可操作连接的一种或更多种核酸分子的核酸分子。载体可以包括，例如一个或多个可选择的标记物、一个或多个复制起点(例如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点、和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。
9、优选地，所述的重组细胞含有所述的重组表达载体，或其染色体中整合有外源的所述的核酸分子。
10、本发明的第三个目的是提供一种酶制剂，包含所述的bap4h突变体。
11、本发明的第四个目的是提供前述的bap4h突变体、核酸分子、重组表达载体、重组细胞、含bap4h突变体的酶制剂在催化重组胶原蛋白脯氨酸羟基化中的应用。
12、优选地，所述的应用是将所述的bap4h突变体与重组胶原蛋白共表达以催化重组胶原蛋白脯氨酸的羟基化，包括以下步骤：
13、i)将所述的bap4h突变体的编码基因构建至pgro-strep质粒和将重组胶原蛋白的编码基因构建至pet28a质粒混合后共转至大肠杆菌rosetta感受态细胞中，涂于双抗lb固体培养基上过夜培养；
14、ii)将平板上长出的单菌落挑取至液体soc双抗培养基中，37℃、220rpm，过夜培养作为种子液；
15、iii)将种子液接种至双抗lb液体培养基培养并加入阿拉伯糖，加入终浓度1mmiptg诱导培养。
16、更优选地，是将种子液接种至双抗lb液体培养基培养1h后加入终浓度2mg/ml的阿拉伯糖。
17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18、本发明提供了bap4h突变体，能对重组胶原蛋白进行高效羟化，并进一步增强了重组胶原蛋白的稳定性；本发明还优化了重组细胞培养的条件。
1.一种bap4h突变体，其中所述突变体能高效羟化重组胶原蛋白，在对应于如下位置的一个或多个位置处包含修饰，该位置选自seq id no.1的多肽的位置3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、37、38、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、83、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、121、125、126、127、129、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、150、151、152、154、155、156、157、158、159、163、164、165、166、167、169、171、172、173、175、179、184、186、187、188、189、190、191、192、193、194、196、199、200、201、202、205、206、207、211、212、213、214和217，其中各修饰独立地为取代或缺失，其中所述变体与seq id no.1的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
2.根据权利要求1所述的变变体，其中所述改变是取代，其中针对不同的氨基酸残基所述在一个位置处的天然存在的氨基酸残基的取代产生了bap4h突变体，该变变体与重组胶原蛋白共表达，可以有效提高其羟化率及稳定性。
3.根据权利要求1所述的变变体，其中所述改变是缺失，其中针对不同的氨基酸残基所述在一个位置处的天然存在的氨基酸残基的缺失产生了bap4h突变体，该变变体与重组胶原蛋白共表达，可以有效提高其羟化率及稳定性。
4.权利要求1所述的bap4h突变体，其特征在于，所述修饰的位置及其突变前后氨基酸选自以下任一项：由以下组成的组：n3s、n4s、n5s、i7m、g8n、e9r、n10e、k11i、e12k、t14e、i15r、d17a、h18d、k19d、g20e、n21s、i23h、k24t、t25a、e26r、d27缺失、r28k、e29a、i30f、i32缺失、i33缺失、s34e、k35g、e37s、e38n、l40m、i41p、l44y、g45y、n46a、l48s、s49e、d50a、e51w、e52缺失、d54a、e55v、l56n、i57k、e58w、l59q、s60a、k61缺失、s62e、k63l、l64t、a65n、r66p、s67a、k68a、g70t、s71l、s72缺失、r73t、d74a、n76s、d77p、i78a、r79a、r79t、r79s、r79l、s81l、s82缺失、g83n、a84t、l86k、d87k、d88v、n89e、e90s、l91v、t92m、a93d、k94l、i95v、e96m、k97q、r98s、i99d、s100缺失、s101a、i102a、n104q、a107t、s108k、h109l、g110s、e111m、g112a、l113a、h114d、i115e、l116缺失、n117s、e119k、d121g、k125y、a126w、h127l、d129k、a132q、e133v、h134t、h134d、h134s、h134k、s135n、r136e、s137m、a138n、a139r、n140s、n141e、r142e、i143s、s144v、t145d、l146k、l150y、n151q、d152g、e154a、e155s、g156n、g157m、e158a、t159d、k163s、l164v、n165w、l166q、s167h、h169i、r171i、k172a、g173r、a175t、e179p、d184w、s186f、l187k、n188a、e189v、l190i、t191p、l192g、h193a、g194m、g195缺失、a196c、t199s、k200v、g201m、e202q、i205v、a206k、t207s、r211a、r212y、g213p、t214q和e217n以及其组合。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1、4任一项中所述的bap4h突变体的核苷酸序列或其互补序列。
6.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求5中所述的核酸分子。
7.权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体是pgro 7，并且在pgro 7上添加strep-tag。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞中含有权利要求6中所述的重组表达载体，或其染色体中整合有外源的权利要求5中所述的核酸分子。
9.一种酶制剂，其特征在于，包含如权利要求1、4任一项中所述的bap4h突变体。
10.权利要求1、4任一项中所述的bap4h突变体，或权利要求5所述的核酸分子，或权利要求6所述的重组表达载体，或权利要求8所述的重组细胞，或权利要求9所述的酶制剂在催化重组胶原蛋白脯氨酸羟基化中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，是将种子液接种至双抗lb液体培养基培养1h后加入终浓度2mg/ml的阿拉伯糖。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，是将种子液接种至双抗lb液体培养基培养1h后加入终浓度2mg/ml的阿拉伯糖。
