本发明属于细胞培养微载体的制备，具体涉及一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体及其制备方法。
背景技术：
1、微载体是指直径在60～250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠，可用于细胞培养，其主要由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、pjema微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体及磁性微载体等。
2、随着细胞生物学和与生物材料的发展，微载体的重要性日渐凸显，并被用作干细胞的规模化培养、医美填充物和局部注射治疗疾病等用途。目前市面上的细胞培养微载体主要以胶原蛋白或明胶等为主，胶原蛋白作为一种天然的生物高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性及低免疫原性，被广泛应用于细胞微载体的制备。然而由于微载体在三维系统中使用场景的复杂性，如机械强度差，注射入体内后降解较快，无法为细胞提供稳定的支撑和保护作用。
3、透明质酸是由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的酸性粘多糖，具有良好的生物相容性，已经广泛应用在医药领域。由于天然透明质酸钠稳定性较差，对透明质酸钠酶和自由基敏感，在体内保持时间短、机械强度差，因此需要通过化学修饰和交联来增强透明质酸钠的机械性能和抗酶解性能，从而可以在体内维持更长的时间。
4、交联透明质酸钠微球呈现圆润的球状，但是表面光滑无棱角，这种形态不利于细胞的粘附和增殖。因此制备具有孔隙结构的交联透明质酸钠微载体将会有利于细胞的粘附及增长，该方面的研究目前较少。
5、交联透明质酸钠微球的制备常选择反向乳化交联法制备，具体为水相为透明质酸的碱性溶液，油相采用液体石蜡，span80为乳化剂，乳化得到w/o型乳化剂，然后加入交联剂制备，但由于在油相中进行交联，难以保证交联反应的均匀性，且交联效率不高，微球的机械性能不高，而且容易破碎，不适用于细胞培养微载体。因此，可用于作为微载体的交联透明质酸钠多孔微球的开发仍面临诸多困难。
6、中国专利文献cn 111840638 a公开了一种注射用交联透明质酸填充剂的制备方法，该方法提供低温控制反向乳化交联技术制得交联透明质酸钠微球，在低温下混合均匀得到水相，然后将水相加入含有乳化剂的油相中乳化得到乳化液，然后将乳化液在交联温度下进行交联，而后去除油相并后处理得到交联透明质酸微球。该方法对温度要求较高，不利于放大生产。
7、中国专利文献cn 114369264 a公开了一种交联透明质酸钠微球及其制备方法，首先将透明质酸钠钠溶于碱液中，喷雾干燥或真空冷冻干燥后再液氮中研磨，制备羟基化的透明质酸钠微球，再将其分散于透明质酸钠的不良溶剂中加入交联剂进行交联反应。该方法制得透明质酸钠的球形度好，但交联不够均匀。此外制备的交联透明质酸钠微球为表面光滑的微球，不利于细胞的粘附与生长。
8、中国专利文献cn 116535728 b公开了一种多孔高分子微球及其制备方法，通过微球控方法，制备而得的微球以聚乙二醇为骨架，以透明质酸钠为单体，共同形成交联物质，以海藻酸钠溶液为内水相，以聚乙烯醇溶液为连续相，配合形成具有较高生物相容性、细胞相容性的多孔高分子微球。但该方法是以聚乙二醇和透明质酸接枝而成，交联程度较低，故其机械性能也较低。此外，通过碱液处理使其微球水解所致孔，开孔大小难以控制。
9、中国专利文献cn 104225677 b公开了一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法，其是以分子量不同的透明质酸钠进行交联制备而得。此发明细胞支架材料的制备方法包括两次冷冻干燥步骤，第一次将混合了交联剂的透明质酸盐成型，加热反应后，加水溶胀为凝胶，再次冷冻干燥获得多孔支架材料。该支架可作为组织工程细胞支架用于促进软骨损伤的修复，也可用作制备止血、防粘连的材料，但此方法中所制备的细胞支架材料为片状或块状，非球状，不具备可注射性。另外，支架材料交联和成孔分别通过第一次和第二次冻干，其交联不够均一，且冻干后机械强度一般，无法满足细胞长时间培养的要求。
10、因此，如何提代一种交联透明质酸钠多孔微球微载体的制备方法，以期获得一种表面多孔、可注射的微球，并具备良好的机械强度和孔隙，能够很好满足细胞生长和粘附的要求，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体及其制备方法。本发明的技术目的在于，解决现有的制备方法存在交联透明质酸钠多孔微球的孔隙不够、交联度不够，同时机械强度不够，无法满足细胞生长和粘附的要求。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
3、本发明首先提供了一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)水相溶液的制备：将透明质酸钠与碱性溶液混合，然后向得到的透明质酸钠溶液中加入交联剂，所述交联剂为碳二亚胺、1,4丁二醇二缩水甘油醚或二乙烯基砜中的一种或多种，交联剂的添加量以透明质酸钠溶液的体积占比计为0.1～2％，搅拌分散均匀，于热水浴中静置进行预交联反应，制备成水相溶液；
5、(2)油相溶液制备：将油性物质与乳化剂混合，经过乳化剪切，制备成油相溶液；
6、(3)乳化：将水相溶液与油相溶液混合后乳化，得到乳化液；所述水相溶液和油相溶液的体积比为1:3～10，乳化的转速为800～3000rpm，乳化时间为10min；
7、(4)搅拌固化：将步骤(3)所得乳化液于搅拌下进行进一步固化交联；
8、(5)对步骤(4)所得物进行清洗，然后进行表面处理，采用的表面处理液为碳酸氢铵，表面处理液的浓度为0.3～3wt％，处理时间为1～4h，所得样品经冻干，即得所述多孔微球细胞微载体。
9、本发明按照上述方法制备得到了一种表面具有丰富孔隙结构且具有优异机械强度的交联透明质酸钠微载体，其有利于细胞的粘附及增殖，且所制得的微载体粒径均匀，球形度高，孔隙丰富，可用于细胞培养、医美填充及体内局部注射等多种用途。本发明的上述制备方法，是先在透明质酸钠的碱溶液中加入交联剂在水浴条件下静置进行轻中度预交联，然后经乳化剪切后继续搅拌进一步交联固化，通过分步交联的方法，一方面可以提高交联度改善其机械强度，另一方面在水相中交联确保了交联的均匀性。
10、在上述分步交联的基础上，进一步通过本发明的表面处理步骤，可进一步改善交联后透明质酸钠的表面形貌，使得交联透明质酸钠微球的孔隙结构更加丰富均匀，同时利用交联透明质酸钠的稳定性提高了微载体的机械性能，从而可以在体内维持一定的时间以提供一定的支撑与保护，很好实现了对可注射细胞培养微载体的结构要求。
11、此外，通过本发明的分步交联和表面处理方法，在实现微载体表面多孔微球和较高机械强度的制备时，还可以减少交联剂的使用量，从而降低成本。本发明方法可以大批量生产上述多孔微球微载体，且微载体的粒径可根据需求进行调控，适合工业化生产。
12、进一步的是，步骤(1)中所述热水浴的温度为50℃，反应时间为1h。
13、进一步的是，步骤(1)中所述透明质酸钠溶液的浓度为5～15wt％，透明质酸钠的分子量为80～150万道尔顿。
14、进一步的是，步骤(1)中所述碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，其质量浓度为0.5～2wt％。
15、进一步的是，步骤(2)中所述油性物质为植物油、矿物油、液体石蜡中的任一种；所述乳化剂为span80或吐温60。
16、进一步的是，步骤(2)中乳化剪切的转速为2000～4000rpm，处理时间为3～5min。
17、进一步的是，步骤(4)中所述搅拌的条件为在100rpm转速下搅拌13h以上。
18、进一步的是，步骤(5)中所述清洗的步骤为：先用环己烷清洗，静置分层，弃去上层油相；再用乙酸乙酯搅拌清洗，静置分层，弃去上层油相；再用无水乙醇搅拌清洗，静置分层，弃去上层油相。
19、进一步的是，环己烷清洗的次数为3次，清洗时间为10～30min，乙酸乙酯搅拌清洗的次数为2次，清洗时间为10～30min，无水乙醇搅拌清洗的次数为2次，清洗时间为5～10min。
20、进一步的是，步骤(5)中所述表面处理的步骤为：将清洗后的样品加入到表面处理液中搅拌浸泡处理，待分层后弃去上层液体，然后用纯化水清洗；样品与表面处理液的体积比为1:10～20，纯化水清洗的次数为2次，清洗时间为10～15min。
21、本发明的目的之二是提供由如上所述方法制备得到的一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体，该多孔微球细胞微载体的粒径大小为40～500μm，孔隙大小为10～90μm。
22、本发明的有益效果如下：
23、(1)本发明制备的交联透明质酸钠多孔微球具备表面孔结构丰富、孔隙度均匀，适合作为微载体，可用于长时间的细胞培养，利于细胞的粘附和增殖生长；
24、(2)本发明的制备方法交联度高、机械强度高、且交联剂的用量少，适合工业化生产。
1.一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述热水浴的温度为50℃，反应时间为1h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述透明质酸钠溶液的浓度为5～15wt％，透明质酸钠的分子量为80～150万道尔顿。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，其质量浓度为0.5～2wt％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述油性物质为植物油、矿物油、液体石蜡中的任一种；所述乳化剂为span80或吐温60。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中乳化剪切的转速为2000～4000rpm，处理时间为3～5min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述搅拌的条件为在100rpm转速下搅拌13h以上。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述清洗的步骤为：先用环己烷清洗，静置分层，弃去上层油相；再用乙酸乙酯搅拌清洗，静置分层，弃去上层油相；再用无水乙醇搅拌清洗，静置分层，弃去上层油相；优选的，环己烷清洗的次数为3次，清洗时间为10～30min，乙酸乙酯搅拌清洗的次数为2次，清洗时间为10～30min，无水乙醇搅拌清洗的次数为2次，清洗时间为5～10min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述表面处理的步骤为：将清洗后的样品加入到表面处理液中搅拌浸泡处理，待分层后弃去上层液体，然后用纯化水清洗；样品与表面处理液的体积比为1:10～20，纯化水清洗的次数为2次，清洗时间为10～15min。
10.由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的一种预交联透明质酸钠多孔微球细胞微载体，其特征在于，所述多孔微球细胞微载体的粒径大小为40～500μm，孔隙大小为10～90μm。
